喻言，鐘紅珊

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院放射科，沈陽 110001）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是高發(fā)病率的惡性腫瘤，具有高死亡率和轉移率的特點。HCC是原發(fā)性肝癌的一種高度侵襲性亞型，具有轉移潛力和低生存率，占所有原發(fā)性肝癌的75%～85%［1-2］。HCC的早期癥狀和生物標志物通常難以識別，因此，很少能在早期確診，而確診時往往已經處于晚期階段，從而降低了治愈率。目前，HCC的治療方法主要包括手術、化學治療、放射治療和分子靶向治療［3-4］。即使經過綜合治療后，HCC患者的5年生存率仍低于60%［5-6］。在分子靶向治療的研究中，環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）對肝癌細胞代謝的影響是目前的研究熱點之一［7］。circRNA是一類非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA），具有可與信使RNA（message RNA，mRNA）結合的微小RNA（microRNA，miRNA）響應元件，從而可促進miRNA調控基因的能力。作為miRNA的分子海綿，circRNA能抑制miRNA靶基因，影響轉錄后調控［8-11］。既往研究表明，circRNA在多種腫瘤中異常表達。有研究［12］顯示，circSEC31A（hsa_circ_0001421）在非小細胞肺癌細胞高表達，并可通過調控miR-376a影響非小細胞肺癌細胞的惡性生物學行為。但circRNA在肝癌中的表達和功能迄今尚無報道。

腫瘤細胞的異?？焖僭鲋嘲殡S著細胞代謝異常旺盛。肝癌細胞糖代謝較正常細胞旺盛。即使在有氧情況下，肝癌細胞也依賴糖酵解維持快速生長的需求，稱為瓦伯格效應。大量研究［13-15］證實，抑制肝癌細胞有氧糖酵解能夠抑制腫瘤細胞生長。本研究擬探討circSEC31A在HCC組織和肝癌細胞HepG2中的表達水平，以及外源性敲減circSEC31A對HepG2細胞增殖和有氧糖酵解的影響，旨在為HCC的診斷和治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 肝癌組織和細胞：人HCC組織15例均取材自2020年6月至12月中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院普通外科肝癌切除術中。用于陰性對照的肝臟組織7例取材自同期腹部外傷肝臟破裂急診減壓組織。所有組織離體后立即置入液氮中凍存。本研究已獲得中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院倫理委員會批準。所有患者均已簽署知情同意書。正常肝細胞株WRL68和肝癌細胞株HepG2購自中科院上海細胞庫。

1.1.2 主要試劑：Trizol試劑、lipofectamine3000、Opti-MEM?Ⅰ（美國Invitrogen公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Corning公司）；胎牛血清、RNase R（美國ThermoFisher公司）；DMSO（美國Sigma公司）；TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan?Universal Master Mix Ⅱ（美國Ambion公司）；circBACH2引物設計及合成（中國上海閃晶公司）；circBACH2沉默質粒（蘇州吉瑪公司）；EdU Kit（廣州銳博科技公司）；細胞能量代謝實時測定儀/生物能量代謝測定儀XF96（美國海馬公司）；丙酮酸激酶活性檢測試劑盒（美國Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取和實時熒光定量PCR：應用Trizol 試劑提取肝癌組織和HepG2細胞總RNA，加入RNase R降解線狀RNA，RNA樣品稀釋后測定濃度。應 用Taqman? MicroRNA Reverse Transcription Kit反轉錄RNA，應用TaqMan? Universal Master Mix Ⅱ和TaqMan MicroRNA Assay（circSEC31A和GAPDH）行實時熒光定量PCR。PCR 反應體系 20 μL 包含 TaqMan Universal Master Mix Ⅱ和Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit，Mix 10 μL、正向及反向引物各0.4 μL、C×R 0.2 μL、cDNA 2 μL及無核酸酶水 7 μL。反應條件：預變性 95 ℃ 2 min，95 ℃變性 15 s，退火 60℃ 1 min，40 個循環(huán)。circSEC31A上游引物序列為5’-CCAGTGAGAGCCTTGGATGT-3’，下游引物序列為5’-TGAGCAGATGTTCCTGTTGC-3’；GAPDH上游引物序列為5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物序列為5’GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。應用7500Fast Real-TimePCR System測定Ct值，以GAPDH為內參照，以2-ΔΔCt表示circRNA的相對表達量。

1.2.2 細胞轉染及分組：24孔板內接種HepG2細胞（5×104/孔），待細胞生長至70% 融合時，按照lipofectamine3000說明書，分別應用circSEC31A沉默質粒載體以及空對照轉染HepG2細胞，用0.4 mg/mL G418篩選細胞。4周后，篩選出穩(wěn)定轉染的細胞系，分為空白對照組、轉染circSEC31A沉默質?？瞻讓φ眨╯h-NC）組和轉染circSEC31A沉默質粒（shcircSEC31A）組。

1.2.3 EdU法檢測細胞增殖：制備HepG2細胞懸液，接種于96孔板（1×104/孔）。培養(yǎng)24 h后，各組終止反應，棄培養(yǎng)液。加入100 μL事先配制的EdU溶液，孵育4 h。熒光顯微鏡下觀察計數(shù)，綠色熒光為陽性染色細胞。

1.2.4 細胞代謝檢測：應用H-2DG試劑盒檢測HepG2細胞的葡萄糖攝取量，無血清培養(yǎng)法檢測乳酸產量，細胞能量代謝實時測定儀檢測細胞氧耗量，糖酵解通量分析檢測細胞糖酵解速率。

1.2.5 Western blotting：利用蛋白提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提取Hep2G細胞總蛋白，定量后行SDS-PAGE分離目的蛋白，轉移至PVDF膜，封閉2 h，加入有氧糖酵解相關蛋白缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor 1 alpha subunit，HIF-1α）一抗（美國Abcam公司，稀釋比例1 ∶200）4 ℃過夜，加入二抗（美國Santa公司，1 ∶500）室溫孵育1 h，顯色后GelDoc XR Biorad凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）下掃描拍照。以GAPDH（抗體購自美國Santa公司）為內參。采用Image J軟件分析每個樣本蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值之比，以其比值作為目的蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)采用表示，組間比較采用t檢驗。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 circBACH2在HCC組織和HepG2細胞中的表達

實時熒光定量PCR檢測結果顯示，與正常對照肝 組織（1.006±0.118）和 正常肝細胞WRL68（1.000±0.025）相比，circSEC31A在HCC組織（5.039±0.449）及HepG2細胞（4.002±0.313）中的表達水平均顯著上調（均P＜ 0.01），見圖1。

圖1 circSEC31A在HCC組織和HepG2細胞中的表達Fig.1 Expression of circSEC31A in hepatocellular carcinoma tissues and HepG2 cells

2.2 沉默circSEC31A抑制HepG2細胞的增殖

EdU染色檢測結果顯示，與空白對照組相比，sh-NC組細胞增殖能力無顯著變化。與sh-NC組相比，sh-circSEC31A組的細胞增殖能力顯著下降（P＜ 0.01），見圖2。提示沉默circSEC31A能顯著抑制HepG2細胞的增殖。

2.3 沉默circSEC31A抑制HepG2細胞的有氧糖酵解

葡萄糖攝取實驗結果顯示，與空白對照組相比，sh-NC組細胞有氧糖酵解水平無顯著變化。與sh-NC組相比，sh-circSEC31A組的細胞有氧糖酵解水平顯著降低（P＜ 0.01），見圖3。提示沉默circSEC31A能顯著抑制HepG2細胞的有氧糖酵解。

2.4 沉默circSEC31A抑制有氧糖酵解相關蛋白HIF-1α的表達

Western blotting結果顯示，sh-NC組與空白對照組HIF-1α表達水平無統(tǒng)計學差異；與sh-NC組相比，sh-circSEC31A組HIF-1α蛋白表達水平顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01），見圖4。提示沉默circSEC31A能顯著抑制有氧糖酵解相關蛋白HIF-1α的表達。

3 討論

肝癌是最常見的惡性原發(fā)性腫瘤，盡管手術方式不斷完善，放化療手段不斷創(chuàng)新，其5年生存率仍低于60%。因此，探討肝癌發(fā)生發(fā)展的機制非常重要。近年來的研究提示ncRNA調控網(wǎng)絡在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮至關重要的作用。

圖2 沉默circSEC31A對HepG2細胞增殖的影響 ×200Fig.2 Knockdown of circSEC31A inhibited HepG2 cells proliferation ×200

圖3 沉默circSEC31A對HepG2細胞有氧糖酵解的影響Fig.3 The effect of circSEC31A silence on aerobic glycolysis in HepG2 cells

圖4 沉默circSEC31A抑制HepG2細胞HIF-1α的表達Fig.4 Knockdown of circSEC31A reduced HIF-1α expression in HepG2 cells

人類基因組的大部分并不編碼蛋白質，但是可以剪切成ncRNA，例如miRNA、長鏈非編碼RNA或circRNA。circRNA是封閉的RNA，起源于pre-RNA的反向剪接，因此缺少3’和5’結構。它是一種內源性RNA，在真核細胞中很常見，具有基因調控功能。大多數(shù)circRNA位于細胞質中，少數(shù)位于細胞核中。circRNA非常穩(wěn)定，不易被RNase R降解。隨著高通量測序和生物信息學技術的發(fā)展，circRNA在越來越多的腫瘤中被發(fā)現(xiàn)。circRNA-9119能通過下調miR-26a//JAK1/STAT3通路的活性抑制肝癌細胞的凋亡［11］；circPIP5K1A可以通過海綿吸附miR-671-5p，激活PI3K-AKT信號通路，從而促進胃癌的進展［16］。circRNA具有穩(wěn)定表達的特點，半衰期長，在多種腫瘤中呈特異性表達，因此，circRNA已成為一種新型的腫瘤生物標志物，用于腫瘤的早期診斷和篩查［17］。

本研究結果顯示，circSEC31A在HCC組織和HepG2細胞中高表達。EdU法檢測結果顯示，將circSEC31A的沉默質粒轉染入HepG2細胞后，HepG2細胞的增殖水平顯著下降，表明沉默circSEC31A表達可抑制HepG2細胞的增殖能力。同時，本研究結果還證實了沉默circSEC31A能夠降低HepG2細胞的有氧糖酵解水平，并顯著下調有氧糖酵解相關蛋白HIF-1α的表達。研究顯示，腫瘤細胞有氧糖酵解的發(fā)生均伴隨著HIF-1α表達水平的上調，然而，本研究中circSEC31A調控HIF-1α的具體機制仍有待進一步研究。

綜上所述，本研究證實了circSEC31A在HCC組織和HepG2細胞中表達上調，在HepG2細胞中發(fā)揮促癌基因的作用，因此，circSEC31A有可能成為未來肝癌精準治療的基因新靶點。circRNA調控腫瘤細胞生物學行為的機制十分復雜，circSEC31A通過何種方式和途徑影響肝癌細胞的惡性生物學行為的機制有待深入探索。