張爽，馬怡然，郝一文

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院輸血科，沈陽 110001）

ABO血型嚴(yán)格遵循孟德爾遺傳方式，A和B基因?yàn)楣诧@性基因，O基因?yàn)殡[性基因。A型是A/A和A/O基因的表達(dá)產(chǎn)物，由于基因的多態(tài)性導(dǎo)致存在很多種ABO亞型［1］。由于亞型編碼基因改變引起編碼氨基酸序列的變化，最終在紅細(xì)胞表面只表達(dá)較弱的A或B抗原，引發(fā)ABO血型鑒定時(shí)出現(xiàn)正反定型不符的情況。本研究回顧性分析臨床工作中發(fā)現(xiàn)的5例A亞型患者的血型血清學(xué)特點(diǎn)，探究A亞型的血型鑒定流程以指導(dǎo)臨床輸血。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選取2016年8月至2019年3月于我院住院，經(jīng)ABO血型鑒定正反定型不符并最終鑒定為A亞型標(biāo)本5例，其中男3例，女2例；年齡32～70歲，平均年齡為47歲。5例患者均無輸血史、移植史及藥物過敏史。

1.2 試劑與儀器

ABO血型鑒定卡及coombs卡購自西班牙Grifols公司；標(biāo)準(zhǔn)ABO試劑紅細(xì)胞、抗體篩選紅細(xì)胞、抗AB、抗H、抗A1抗體及A2細(xì)胞購自上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司；單克隆抗A、抗B血型定型試劑購自長春博德生物技術(shù)有限責(zé)任公司；人源多克隆抗A、人源多克隆抗B為實(shí)驗(yàn)室自制；以上所有試劑均在效期內(nèi)使用。ABO血型基因分型及基因測序檢驗(yàn)由天津秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供。

1.3 方法

5例標(biāo)本 ABO、Rh血型鑒定均采用微柱凝膠卡式法及試管法分別在不同溫度條件下檢測，微柱凝膠卡式法按照廠家說明書操作，試管法按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》［2］中方法操作；標(biāo)本不規(guī)則抗體篩檢試驗(yàn)采用微柱凝膠卡式法，按照廠家說明書操作；紅細(xì)胞直接抗人球蛋白試驗(yàn)、吸收放散試驗(yàn)均按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》方法操作。

2 結(jié)果

2.1 ABO血型血清學(xué)結(jié)果

5例患者標(biāo)本初次經(jīng)微柱凝膠卡式法檢測，均出現(xiàn)ABO血型正反定型不符的情況，見表1。按疑難血型鑒定流程，采用試管法，增加抗H、抗AB、A1細(xì)胞、A2細(xì)胞、O細(xì)胞等試劑分別于室溫及4 ℃對上述患者標(biāo)本進(jìn)一步進(jìn)行血型血清學(xué)鑒定，見表2。

2.2 標(biāo)本不規(guī)則抗體篩查結(jié)果

5例標(biāo)本不規(guī)則抗體篩檢試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，說明患者血漿中不存在ABO系統(tǒng)以外的不規(guī)則抗體。

表1 5例患者ABO、RhD血型微柱凝膠卡鑒定結(jié)果

表2 5例患者試管法ABO血型鑒定結(jié)果

2.3 標(biāo)本紅細(xì)胞直接抗人球蛋白試驗(yàn)結(jié)果

5例標(biāo)本紅細(xì)胞直接抗人球蛋白試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，提示患者紅細(xì)胞未被抗體或補(bǔ)體致敏。

2.4 標(biāo)本紅細(xì)胞吸收放散試驗(yàn)（表3）

5例標(biāo)本放散液與3%～5% 濃度A型紅細(xì)胞均發(fā)生凝集，而對照管均不凝集，證實(shí)5例患者紅細(xì)胞上均存在A抗原。

表3 吸收放散試驗(yàn)結(jié)果

2.5 PCR-SSP基因分型及基因測序

采用EDTA-K2真空采血管采集4例患者抗凝全血5 mL，由天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司進(jìn)行血型基因分型檢測，結(jié)果證實(shí)4例患者ABO血型基因型均為A亞型，其中標(biāo)本1基因型為Ael02/O02、標(biāo)本3基因型為Ael05/O02、標(biāo)本4基因型為A307/O02、標(biāo)本5基因型為Ael04/O02；標(biāo)本2未進(jìn)行基因分型檢測。另對標(biāo)本1進(jìn)行ABO血型基因測序，見圖1、圖2，表4。

2.6 患者輸血及輸血后評估

5例患者中有2例患者進(jìn)行了術(shù)中輸血，分別輸注了配血相合的O型懸浮紅細(xì)胞6單位，輸血過程順利，輸血后無輸血不良反應(yīng)，5例患者均已治愈出院。

3 討論

圖1 EXON6測序結(jié)果

ABO血型亞型是由于基因突變，導(dǎo)致紅細(xì)胞表面A抗原或B抗原表達(dá)數(shù)目減少，因此與抗A或抗B抗血清反應(yīng)出現(xiàn)凝集強(qiáng)度減弱的現(xiàn)象，具有遺傳基礎(chǔ)和明確的血清學(xué)特點(diǎn)［3］。正常A型紅細(xì)胞與抗A1的凝集強(qiáng)度可達(dá)到4+，而A亞型的紅細(xì)胞與抗A1幾乎不反應(yīng)，但Ax型紅細(xì)胞與抗AB反應(yīng)和抗A相比有明顯增強(qiáng)［4］；A亞型與抗H凝集強(qiáng)度普遍強(qiáng)于正常同型紅細(xì)胞［5］。A3型紅細(xì)胞典型特征是出現(xiàn)混合視野凝集［6］，本文病例4為A3亞型，符合這一特征。有些亞型（如Ax、Ael），其血清中經(jīng)常存在抗A1抗體［7］，可以作為與其他A亞型進(jìn)行鑒別的特征；Ael亞型常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法檢測不出A抗原，但吸收放散實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驒z出弱的A抗原［8］。當(dāng)ABO血型鑒定出現(xiàn)正反定型不符的情況，首先應(yīng)排除人為因素、技術(shù)因素、生理因素、病理因素及臨床治療的影響［9］。因此，應(yīng)采用試管法并增加抗AB、抗H、抗A1等鑒定輔助試劑在不同溫度下進(jìn)一步對比檢測及鑒別，有些亞型的弱凝集在4 ℃更容易出現(xiàn)。對反定型疑為A型，但正定型未檢出A抗原標(biāo)本應(yīng)進(jìn)行吸收放散試驗(yàn)，以證實(shí)A抗原的存在。類孟買血型也存在紅細(xì)胞A或B抗原缺失或弱表達(dá)，但類孟買型紅細(xì)胞由于缺乏H抗原，一般不與抗H發(fā)生凝集，因此可應(yīng)用抗H加以區(qū)分［10］。本文5例患者紅細(xì)胞經(jīng)過吸收放散實(shí)驗(yàn)，放散液均檢出達(dá)3+～4+強(qiáng)凝集，吸收放散試驗(yàn)可幫助證實(shí)是否存在弱A抗原［11］。雖然血型血清學(xué)試驗(yàn)不能作為患者ABO血型亞型的結(jié)論，但在緊急情況下，可以較快指導(dǎo)臨床選擇出合適血型的血液制劑。對于病情穩(wěn)定的患者應(yīng)該進(jìn)行ABO血型基因分型及基因測序，完成家系調(diào)查，明確亞型形成的遺傳學(xué)原因。本文5例患者紅細(xì)胞經(jīng)過ABO血型基因檢測及測序，證實(shí)病例4的血型為A3，病例1、3、5為Ael，與血型血清學(xué)檢測的推斷結(jié)論一致；病例1患者ABO血型初檢格局符合O型，但反定型與A1細(xì)胞反應(yīng)凝集減弱，容易誤判為O型，經(jīng)吸收放散試驗(yàn)證實(shí)患者紅細(xì)胞上存在弱的A抗原，血型血清學(xué)符合Ael含抗A1抗體。對病例1進(jìn)行ABO基因第1～7外顯子測序分析，患者ABO 基因第 7 外顯子存在堿基467C＞T；646T＞A；681G＞A突變，此3個(gè)突變分別引起氨基酸替換P156L；F216I，經(jīng)檢索血型抗原基因突變數(shù)據(jù)庫顯示突變的等位基因?yàn)锳el02［12］。另一等位基因除了第6外顯子堿基261delG；297A＞G突變外，第7外顯子還出現(xiàn)堿基646T＞A；681G＞A；771C＞T；829G＞A突變，此6個(gè)突變分別引起氨基酸替換V36F；R63H；P74S；88fs+truncation，經(jīng)檢索血型抗原基因突變數(shù)據(jù)庫顯示突變的等位基因?yàn)镺02。所以此標(biāo)本基因型為Ael02/O02。

圖2 EXON7測序結(jié)果

表4 標(biāo)本1基因測序結(jié)果判定

對于血液制劑的選擇，毫無疑問同型供血者是最佳選擇，但在現(xiàn)實(shí)情況下很難得以實(shí)現(xiàn)。若血清中未檢出抗A1 抗體，可以用抗A1試劑隨機(jī)篩選A型獻(xiàn)血者，選擇與其不反應(yīng)的配血相合紅細(xì)胞進(jìn)行輸注。在緊急情況下，對于不能獲得抗A1試劑的醫(yī)療機(jī)構(gòu)，為了避免同種抗體產(chǎn)生，可為患者選擇配血相合的O型懸浮紅細(xì)胞或洗滌紅細(xì)胞（對于新生兒、兒童患者請選擇O型洗滌紅細(xì)胞）、A型血漿和A型血小板進(jìn)行輸注。