張靖悅，張倩也，陳信楨，張國培，肖明揚，逯曉波

（中國醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生毒理學教研室，沈陽 110122）

遺傳與環(huán)境因素共同作用是結直腸癌（colorectal cancer，CRC）發(fā)生的機制［1］。環(huán)境有害因子可與DNA結合造成DNA損傷。切除修復交叉互補基因1（excision repair cross-complementary enzyme 1，ERCC1）的表達水平和DNA損傷的修復活性密切相關，且其單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點與CRC的易感性存在關聯(lián)［2］。此外，反義切除修復交叉互補因子1（CD3e molecule，epsilon associated protein，CD3EAP）基因與PPP1R13L（protein phosphatase 1 regulatory subunit 13 like）基因分別與ERCC1的3’端非編碼區(qū)（3’ -untranslated region，3’ UTR）及5’端重疊，且二者基因的多態(tài)性與CRC的易感性也密切相關［3］。因此，本研究擬通過在中國東北地區(qū)漢族人群中開展病例對照研究，探討中國漢族人群中ERCC1rs3212986、ERCC1rs735482、ERCC1rs2336219、CD3EAPrs1007616和PPP1R13Lrs6966多態(tài)性位點與CRC發(fā)病風險之間的關聯(lián)，為尋找CRC易感性生物標志提供理論依據和科學線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器：DNA提取試劑盒（北京天根生化技術有限公司）；SNP基因探針及引物合成（美國應用生物系統(tǒng)公司）；LightCycler? 480 Probes Master試劑（瑞士Roche公司）。Nanodrop核酸定量分析儀（美國ThermoFisher Scientific公司）；實時熒光定量PCR 儀（瑞士Roche公司）；低溫超速離心機（美國Beckman公司）；CF15D低溫高速離心機（日本Hitachi公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）。

1.1.2 研究對象：本研究采用病例對照研究，研究對象均為來自中國東北地區(qū)無血緣關系的漢族人群。選擇2014年10月至2015年3月在中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院就診的200例原發(fā)性CRC患者作為病例組。選擇于中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院體檢的200名健康志愿者作為對照組，對照組無癌癥病史，并按年齡（±2歲）及性別與病例匹配，在同一地區(qū)和同一時期招募。本研究已獲得中國醫(yī)科大學醫(yī)學倫理委員會批準，并在實施過程中遵守《赫爾辛基宣言》，所有研究對象均簽署知情同意書。通過調查問卷的形式收集研究對象的基本資料，采集外周靜脈血5 mL，EDTA抗凝，置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提?。河肈NA提取試劑盒提取2組DNA后，檢測DNA質量并調整DNA濃度為200 ng/μL，取A260/A280位于1.7～1.9的樣本用于后續(xù)實驗，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 候選SNP位點的確定：根據Hapman（http：//www.hapmap.org）、PubMed（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）和UCSC（http：//www.genome.ucsc.edu）網站提供的中國漢族人群中ERCC1、CD3EAP及PPP1R13L的3’ UTR多態(tài)性位點信息、中國漢族北京人群的最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞0.2及樣本量確定候選SNP位點為ERCC1rs3212986、ERCC1rs735482、ERCC1rs2336219、CD3EAPrs1007616和PPP1R13Lrs6966。具體生物學信息見表1。

1.2.3 基因分型檢測：采用Taqman 水解探針法檢測候選SNP位點在2組人群中的分布頻率。本研究中使用的SNP基因探針及引物由美國應用生物系統(tǒng)公司負責設計并合成，包括rs3212986（ID號：C_2532948_10）、rs735482（ID號：C_341729_10）、rs2336219（ID號：C_16204465_10）、rs6966（ID號：C_2615637_10）、rs1007616（ID號：AH6RTHI）。PCR反應體系（20 μL）：2×LightCycler 480 Probes Master 10 μL，1×probe 5 μL，RNase-free water 3 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 s，共40個循環(huán)；40 ℃冷卻30 s。

表1 候選SNP位點基本信息Tab.1 Basic information of candidate SNP sites

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。年齡呈正態(tài)分布，以（）表示，計數資料用［n（%）］表示，2組間SNP位點連鎖不平衡用Haploview 4.2軟件分析。采用Welch’st檢驗比較2組間年齡差異；χ2檢驗分析SNP位點的基因型在病例組和對照組中的分布差異。采用非條件logistic回歸模型分析SNP位點不同基因型與CRC發(fā)病風險的關聯(lián)，用比值比（odds ratio，OR）及其 95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）表示相對風險度。統(tǒng)計分析采用雙側檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料對比

病例組男女比為113 ∶87，對照組男女比為111 ∶89，2組之間性別差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.041，P=0.840）；納入研究的2組研究對象均以年齡超過50歲的人群為主，約占80%，2組之間年齡差異無統(tǒng)計學差異（t=0.525，P=0.600）。見表2。

2.2 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗結果

表2 病例組與對照組的臨床特征比較Tab.2 Comparison of clinical characteristics in case group and control group

本研究選取的rs3212986、rs735462、rs2336219、rs1007616及rs6966位點對照組基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡（P＞ 0.05）。

2.3 關聯(lián)分析

基因分型結果顯示，ERCC1rs3212986位點的等位基因在病例組與對照組間具有統(tǒng)計學差異（χ2=4.61，P=0.032），PPP1R13Lrs6966位點基因型在2組中的頻率分布具有統(tǒng)計學差異（χ2=6.05，P=0.049），其余SNP位點基因型則均無統(tǒng)計學差異。進一步分析發(fā)現(xiàn)，ERCC1rs3212986位點的AA基因型與CRC的發(fā)生具有相關性（OR=2.53，95%CI：1.14～5.60）；其余SNP位點與CRC的發(fā)病風險關聯(lián)性無統(tǒng)計學意義。見表3。

2.4 分層分析

2.4.1 性別分層：進一步按照性別分層后，男性中rs3212986 位點的AA基因型患CRC的風險增高（OR=4.04，95%CI：1.26～12.97）；在女性中未觀察到這種關聯(lián)。見表4。

2.4.2 年齡分層：根據年齡分布的特點，病例組和對照組的平均年齡分別為62.18歲和61.59歲，因此以60歲作為分層點，將研究對象分為＜60歲和≥60歲2層，在年齡＜60歲人群中，相關性分析未發(fā)現(xiàn)SNP位點與CRC之間的關聯(lián)；而在年齡≥60歲人群中，ERCC1rs3212986位點的AA基因型患CRC的風險增高（OR=7.48，95%CI：1.63～34.3），其余SNP位點未發(fā)現(xiàn)這種關聯(lián)。見表5。

2.5 連鎖不平衡及單倍型分析

2.5.1ERCC1基因單體型結構分析：單體型為一條染色體區(qū)域中所有SNPs 等位基因的集合。對ERCC1基因3個SNP位點進行連鎖不平衡分析，結果顯示，rs3212986、rs735482和rs2336219位點處于強連鎖不平衡（P=0.003），提示AAG單體型可能與CRC患病風險增高有關（OR=1.61，95%CI：1.09～2.37）。此外，構建得到的其他單體型在2組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。見表6。

表3 病例組和對照組中候選SNP位點的等位基因和基因型頻率比較Tab.3 The frequencies of alleles and genotypes of candidate SNP locis in cases and controls

2.5.2 區(qū)域性單體型分析：染色體在傳遞過程中同源片段發(fā)生重組，傳遞多代之后原有的排布已被打亂，而染色體中沒有發(fā)生重組的區(qū)域被重組區(qū)域相互隔開，這些沒有發(fā)生重組的區(qū)域被稱為區(qū)域性單體型。由于rs3212986、rs735482、rs2336219、rs1007616和rs6966位點所在的基因相互之間有重疊，故位點間可能存在連鎖不平衡，故用Haploview4.2軟件進行區(qū)域性單體型分析。結果顯示，rs3212986、rs735482、rs2336219和rs1007616處 于連鎖不平衡（rs6966與其他SNP位點呈較弱連鎖不平衡，所以實際只有4個位點被納入了單體型分析），經統(tǒng)計學分析，在Haploview4.2軟件構建的區(qū)域單體型中，提示CCAC（OR=4.46，95%CI：1.79～11.09）、AAGC（OR=5.64，95%CI：2.23～14.31）、CAGT（OR=4.04，95%CI：1.58～10.31）可能與CRC患病風險增高有關。此外，構建得到的其他區(qū)域單體型在2組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。見表7。

3 討論

CRC具有高發(fā)病率、高死亡率的特點，多數病例預后不良［4］。DNA損傷是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的起始動力，DNA損傷修復基因越來越受到惡性腫瘤研究者的密切關注［5］。作為常見惡性腫瘤，CRC與DNA損傷修復基因有著密不可分的關系，其發(fā)生被認為可能是機體多個DNA損傷修復系統(tǒng)紊亂而產生的不良結局［6］。

表4 不同性別分層分析SNP位點與CRC發(fā)病風險的關聯(lián)Tab.4 The association between SNPs and CRC risk analyzed by gender stratification analysis

表5 不同年齡分層分析SNP位點與CRC發(fā)病風險的關聯(lián)Tab.5 The association between SNPs and CRC risk analyzed by age stratification analysis

表6 ERCC1單體型結構與CRC發(fā)生風險的關聯(lián)Tab.6 The association between the haplotype structures of ERCC1 and the risk of CRC

表7 ERCC1及其重疊基因區(qū)域單體型結構與CRC發(fā)生風險的關聯(lián)Tab.7 The association between the regional haplotype structures of ERCC1 and its overlapping genes and the risk of CRC

研究［7］發(fā)現(xiàn)，DNA修復基因ERCC1的表達水平與CRC發(fā)病有明顯相關性。此外，ERCC1多態(tài)性也與個體DNA修復能力、惡性腫瘤易感性及腫瘤耐藥密切相關。ERCC1rs3212986位點位于基因的3’ UTR區(qū)，本研究發(fā)現(xiàn)其AA基因型患CRC風險升高，提示可能是由于該基因型與較低水平的DNA修復效率和較高水平的DNA損傷有關。這與以往研究rs3212986位點基因型與某些常見癌癥發(fā)生風險的關聯(lián)性相符，如ZHAO等［8］發(fā)現(xiàn)ERCC1rs3212986基因多態(tài)性的TT基因型攜帶個體與TG+GG基因型攜帶個體相比，胰腺癌的易感性更高，特別是在吸煙者中ERCC1rs3212986基因多態(tài)性更有助于胰腺癌的發(fā)展；GENG等［9］也發(fā)現(xiàn)ERCC1rs3212986基因多態(tài)性與神經膠質瘤發(fā)生率顯著相關，AA基因型攜帶者發(fā)生神經膠質瘤的風險是CA+CC基因型攜帶者的1.26倍。因此，提示在某些常見腫瘤的篩查診斷中ERCC1rs3212986位點可以作為有效的早期生物易感標志。

ERCC1rs3212986位點位于ERCC1與CD3EAP的重疊區(qū)域，即同時位于ERCC1的3’ UTR和CD3EAP的編碼區(qū)。因此，ERCC1rs3212986位點的SNP既可以通過影響CD3EAP編碼區(qū)的基因表達，導致CD3EAP轉錄翻譯后生成的氨基酸不同，產生的蛋白質功能出現(xiàn)改變，從而影響細胞增殖，又可以影響ERCC1mRNA的二級結構，導致其與miRNA的結合能力發(fā)生改變，影響miRNA的調控能力，最終導致機體DNA修復能力出現(xiàn)差異，從而影響某些疾病的發(fā)生發(fā)展。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)包含該等位基因的單體型及多態(tài)性區(qū)域CRC的患病風險升高，也提示了該位點在CRC易感性中的重要性。

本研究尚有不足之處，腫瘤的發(fā)生是環(huán)境致癌物與遺傳物質相互作用的結果，由于條件受限，本研究對象未能收集到吸煙、飲酒、飲食習慣、職業(yè)暴露等因素，故不能對環(huán)境與遺傳因素的交互作用與CRC發(fā)病風險的關聯(lián)做進一步的分析，而且受到病例樣本含量的局限，本研究發(fā)現(xiàn)的rs3212986基因多態(tài)性與CRC易感性的關聯(lián)仍需大樣本人群的檢驗等。因此，設計更加嚴密的病例對照研究、擴大樣本含量進行統(tǒng)計學分析，通過生物信息學進行SNP位點的深入功能挖掘，并與遺傳毒理學實驗相結合，也是未來研究的重要方向。