楊博涵 朱旭江

1.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020；2.甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730070

茜芷膠囊是由白芷、茜草、川牛膝、三七組成的復(fù)方制劑，其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家食品量標(biāo)準(zhǔn)提高，在原標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，增加了川牛膝中杯莧甾酮的薄層鑒別，并將原標(biāo)準(zhǔn)中用薄層掃描法測(cè)定歐前胡素的方法改為高效液相色譜法。結(jié)果表明采用高效液相色譜法測(cè)定白芷中歐前胡素(C16H14O4)和異歐前胡素的含量，方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，可作為控制茜芷膠囊的定性和定量指標(biāo)。白芷始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為傘形科植物白芷, 或杭白芷的干燥根[1]，具有散風(fēng)除濕、通竅止痛、消腫排膿的作用[2]，現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明白芷中的有效成分之一歐前胡素屬于香豆素[3]的一種，具有顯著的止血、抑菌、消炎作用[4]。最新研究證實(shí)白芷中呋喃香豆素類化合物具有甲型流感病毒H1N1(Hemagglutinin 1 Neuraminidase 1)和H9N2(Hemagglutinin 2 Neuraminidase 2)的抗病毒活性[5]，初步揭示其抗病毒的作用機(jī)理。筆者曾嘗試測(cè)定茜芷膠囊中阿魏酸、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷R1的含量，結(jié)果測(cè)得的含量均較低，最終本研究采用TLC法對(duì)處方中的川牛膝進(jìn)行定性鑒別，同時(shí)采用高效液相色譜法測(cè)定白芷中歐前胡素和異歐前胡素的含量，進(jìn)行方法學(xué)考察，從而建立一個(gè)操作簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以用于控制該產(chǎn)品的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Waters Alliance e2695型高效液相色譜儀(Waters 2998 DAD檢測(cè)器，Empower色譜工作站，美國(guó)Waters公司)；CAMAG Scanner-3型薄層掃描儀，CAMAG半自動(dòng)點(diǎn)樣儀(瑞士CAMAG公司)；KH-500DE超聲波清洗器(上海超聲波儀器廠)；Mettler AE 240 電子天平(瑞士Mettler公司)；R200D型分析天平(德國(guó)Sartorius公司)； CAMAG Scanner-3型薄層掃描儀。硅膠G薄層板(青島海洋化工廠)；中性氧化鋁柱(100～200目)。

乙腈(色譜純，德國(guó)Merk 公司)、石油醚(60～90℃)、乙醚、正丁醇、乙酸乙酯、硫酸、乙醇、甲醇為分析純，水為超純水。歐前胡素(批號(hào)：110826-201013，含量99.6%)和異歐前胡素(批號(hào)：110827-201109，含量99.7%), 均為中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。茜芷膠囊(批號(hào)：J20160901、J20160902、J20160903、J20160707、J20160829)，均由甘肅新蘭藥藥業(yè)有限責(zé)任公司提供。白芷對(duì)照藥材(批號(hào)：945-9903)，三七皂苷R1對(duì)照品(批號(hào)：110745-200617),茜草對(duì)照藥材(批號(hào)：121049-201003)，川牛膝對(duì)照藥材(批號(hào)：121065-201105)，歐前胡素對(duì)照品(批號(hào)：110826-201013)，杯莧甾酮對(duì)照品(批號(hào)：111804-201303)。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別 川牛膝[6]TLC鑒別 取本品內(nèi)容物約2 g，加甲醇50 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液濃縮至約1 mL，加于中性氧化鋁柱(100～200目，4 g，內(nèi)徑為1 cm)上，用甲醇-乙酸乙酯(1∶1)40 ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取杯莧甾酮對(duì)照品，加甲醇制成每lml含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按處方比例及工藝，取不含川牛膝的陰性樣品同供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》 2015 年版四部通則 0502)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5 μL，分別點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板，以三氯甲烷-甲醇(10∶1)為展開劑展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下或日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，紫外光燈(365 nm)下，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；日光下，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性無干擾。結(jié)果如圖1所示。

溫度：22℃，相對(duì)濕度：45%1. 陰性對(duì)照；2. 杯莧甾酮對(duì)照品；3. 供試品(批號(hào): J20160707)；4. 供試品(批號(hào): J20160901)；5. 供試品(批號(hào): J20160902)圖1 川牛膝(杯莧甾酮)薄層鑒別圖譜

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：資生堂CAPCELL PAK C18( 4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(50∶50)；檢測(cè)波長(zhǎng)：300 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取歐前胡素對(duì)照品11.06 mg，置50 mL容量瓶中, 加甲醇稀釋至刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液1。精密稱取異歐前胡素對(duì)照品13.44 mg，置100 mL容量瓶中, 加甲醇稀釋至刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液2。再分別精密量取上述兩種對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL置100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物10粒，混勻，研細(xì)，精密稱取約0.5g，置25 mL量瓶中，加入甲醇適量，密塞，超聲處理30 min(功率200 W，頻率60 KHz)，放至室溫后，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例及工藝，制成不含白芷的陰性樣品，取陰性樣品按上述供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 方法學(xué)考察 專屬性考察：按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性供試品各20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)得液相色譜圖，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明陰性對(duì)測(cè)定結(jié)果無干擾，且歐前胡素、異歐前胡素色譜分離良好。

1.歐前胡素；2.異歐前胡素；A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照?qǐng)D2 茜芷膠囊的HPLC圖譜

線性關(guān)系考察：取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)的色譜條件，分別進(jìn)樣2.5、5、10、15、20、25、30、40 μL，測(cè)定歐前胡素、異歐前胡素的峰面積，以進(jìn)樣對(duì)照品的質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積的積分值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程，見表1。結(jié)果表明，歐前胡素和異歐前胡素在線性范圍內(nèi)具良好的線性關(guān)系。

表1 歐前胡素和異歐前胡素的線性回歸方程

精密度試驗(yàn)：分別精密吸取歐前胡素和對(duì)照品溶液，按上述色譜條件下進(jìn)樣20 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定對(duì)照品峰面積的積分值，歐前胡素、異歐前胡素的RSD值分別為0.8%和1.3%，結(jié)果表明此方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液，分別在0、8、12、16、24 h按“2.2.1”項(xiàng)的色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，以對(duì)照品峰面積計(jì)算RSD分別為1.1%和1.3%。表明歐前胡素和異歐前胡素在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批號(hào)供試品(批號(hào)J20160901)6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法處理，“2.2.1”項(xiàng)的色譜條件測(cè)定含量，歐前胡素和異歐前胡素RSD為1.9%和1.2%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

加樣回收率：取歐前胡素對(duì)照儲(chǔ)備液制成110.2 μg·mL-1的溶液，分別精密吸取1.1 mL、1.3 mL、1.5 mL各3份，置25 mL用量瓶中；取異歐前胡素對(duì)照儲(chǔ)備液制成67.0 μg·mL-1的溶液，再分別精密吸取0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL各3份，分別置上述相應(yīng)量瓶中，氮吹儀吹干。精密稱取已知含量的茜芷膠囊(批號(hào)：J20160901，約0.25g)各9份，分別置上述量瓶中，依照“2.3”項(xiàng)下的方法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2和表3。

表2 歐前胡素加樣回收率

表3 異歐前胡素加樣回收率

2.2.6 樣品測(cè)定 按供試品溶液的制備方法和測(cè)定方法，對(duì)樣品進(jìn)行制備和測(cè)定，分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品中歐前胡素和異歐前胡素的含量，測(cè)定5批供試品的含量，結(jié)果見表4。

表4 含量測(cè)定結(jié)果 (n=2)

3 討論

3.1 提取方法的選擇 在樣品的處理階段，提取方法的選擇進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行比較。方法一：按照原標(biāo)準(zhǔn)方法采用石油醚(60～90 ℃)索氏提取，蒸干后用乙酸乙酯定容至5 mL，精密取1 mL，蒸干，再用甲醇溶解后定容至100 mL；方法二：取內(nèi)容物精密稱取1 g，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲30 min，取續(xù)濾液20 mL，蒸干，用甲醇溶解后定容至5 mL[6-7]；方法三：取內(nèi)容物精密稱取0.5 g，置25 mL容量瓶中，加入甲醇適量，密塞，超聲處理30 min，放冷，用甲醇稀釋至刻度。將上述三種方法的結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)方法一和方法二在制備的供試品溶液處理上與方法三相比步驟較為復(fù)雜，對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確度影響更大。方法三操作更為簡(jiǎn)便，無需蒸干步驟，大大縮短實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間，可以更快速的得出結(jié)果。且經(jīng)過方法三處理后最終結(jié)果表明所測(cè)成分吸收峰附近無干擾，結(jié)果穩(wěn)定。

3.2 超聲時(shí)間選擇 確定樣品提取時(shí)間時(shí)，按照此方法三步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在超聲處理時(shí)間上分別選取超聲25、30、35、40、50 min，發(fā)現(xiàn)超聲30 min即可將茜芷膠囊中白芷的特征成分提取完全，故最終確定30 min為超聲提取時(shí)間。

3.3 流動(dòng)相的選擇 在含量測(cè)定時(shí)流動(dòng)相的選擇上，曾先后選用甲醇-水(65∶35)[8-9]，乙腈-水(53∶47)[10]，這兩種比例為流動(dòng)相，根據(jù)所測(cè)成分吸收峰進(jìn)行調(diào)整，比例為乙腈-水(50∶50)時(shí)，色譜峰峰形，分離度良好，故選用乙腈-水(50∶50)為流動(dòng)相。

4 結(jié)論

本次質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高實(shí)驗(yàn)，參考中國(guó)藥典[11]，在原標(biāo)準(zhǔn)的三項(xiàng)鑒別項(xiàng)基礎(chǔ)上增加了川牛膝中杯莧甾酮的薄層鑒別。經(jīng)過樣品的試驗(yàn)及方法學(xué)驗(yàn)證研究，結(jié)果表明該方法穩(wěn)定、重現(xiàn)性較好，陰性樣品無干擾。歐前胡素在0.0276～0.4409 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r=0.9999,加樣回收率為99.97%，RSD為1.66%；異歐前胡素在0.0168～0.2680 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r=0.9999，加樣回收率為99.66 %，RSD為1.15%。最終試驗(yàn)結(jié)果表明，該測(cè)定方法操作快捷簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可作為控制茜芷膠囊的定性和定量指標(biāo)，有效控制本品的質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)化提高。