王 璐 劉 勤 張紅宇 王 瑋

云南省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院,云南 昆明 650031

注射用燈盞花素是燈盞花素加入適宜的賦形劑，經(jīng)冷凍干燥制成的無菌制品，其功能主治為活血化瘀、通絡(luò)止痛，是《國家基本醫(yī)療保險、工傷保險和生育保險藥品目錄》中藥注射劑品種，臨床廣泛用于中風(fēng)及其后遺癥，冠心病、心絞痛等缺血性心腦血管疾病。注射用燈盞花素的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國藥典》2015年版一部，其中將野黃芩苷的含量測定作為質(zhì)量控制指標(biāo)，但由于中藥所含活性成分非常復(fù)雜，而且藥效的發(fā)揮往往是多種活性成分共同作用的結(jié)果，因此中藥檢測任何一種活性成分均不能完全體現(xiàn)其整體療效，為了使中藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)能更好地保證每批藥品的臨床使用安全有效，有必要在現(xiàn)有含量測定的基礎(chǔ)上增加生物活性測定檢測項目[1-2]，根據(jù)注射用燈盞花素的功能主治，選取小鼠體內(nèi)血栓實驗、小鼠常壓耐缺氧實驗、小鼠凝血時間實驗來篩選適宜的生物活性測定指標(biāo)。

1 試藥與動物

1號樣品：規(guī)格10 mg，批號20151126-2；2號樣品：規(guī)格10 mg 批號20170302-2 ； 3號樣品：規(guī)格25 mg 批號20151125-2；4號樣品：規(guī)格25 mg 批號20160927-1；5號樣品：規(guī)格50 mg，批號20161104-1；6號樣品：規(guī)格50 mg，批號20161020-1；以上樣品野黃芩苷含量測定分別為標(biāo)示量的98.75%、98.60%、100.35%、99.62%、99.71%、100.17%。注射用燈盞花素最大人用劑量0.83 mg·kg-1。

膠原蛋白I型，酷爾生物，批號：B264565,規(guī)格1g；鹽酸腎上腺素注射液，上海和豐制藥有限公司，批號 10151101，規(guī)格1 mL∶1 mg；注射用鹽酸川芎嗪，合肥平光制藥有限公司，批號201509073，規(guī)格80 mg；尼莫地平注射液，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號16051541，規(guī)格20 mL∶4 mg；血塞通注射液，規(guī)格5 mL∶250 mg 批號ZKC1501，昆明制藥有限公司。

試驗動物：小鼠，由成都達(dá)碩實驗動物有限公司提供，ICR,SPF級別，雌雄兼有，體重18～22 g，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2015-030。

2 實驗方法及結(jié)果

2.1 小鼠體內(nèi)血栓實驗[3]取健康小鼠96只(雌雄兼有)，體重18～20g，隨機(jī)分為注射用燈盞花素組(6個批號共6組)，氯化鈉注射液組(陰性對照組)、鹽酸川芎嗪組(陽性對照組)共8組，每組12只。注射用燈盞花素組按25 mg·kg-1的劑量(臨床人用劑量的30倍)給藥，陽性藥組給予60 mg·kg-1的鹽酸川芎嗪(臨床人用劑量的30倍)。各組均為尾靜脈注射一次給藥，給藥體積0.2 mL/10g，給藥30 min后，尾靜脈注射血栓誘導(dǎo)劑造成小鼠血栓模型，血栓混合誘導(dǎo)劑含膠原蛋白0.60 mg· mL-1和腎上腺素0.02 mg· mL-1，給藥體積0.1 mL/10g，觀察小鼠死亡個數(shù)以及偏癱未恢復(fù)數(shù)(15 min內(nèi))，偏癱率=(死亡個數(shù)+15 min偏癱未恢復(fù)個數(shù))/總個數(shù)，保護(hù)率=(未偏癱個數(shù)+15 min內(nèi)偏癱恢復(fù)個數(shù))/總個數(shù)，陰性組偏癱率大于等于80%說明造模成功。

陽性藥組及4個批號的注射用燈盞花素與陰性組比較，小鼠死亡個數(shù)以及偏癱未恢復(fù)數(shù)(15 min內(nèi))減少，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。2個批號的注射用燈盞花素與陰性組比較小鼠死亡個數(shù)以及偏癱未恢復(fù)數(shù)(15 min內(nèi))減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表1。

2.2 小鼠凝血時間實驗[4]取健康小鼠96只(雌雄兼有)，體重18～20g，隨機(jī)分為注射用燈盞花素組(6個批號共6組)，氯化鈉注射液組(陰性對照組)、鹽酸川芎嗪組(陽性對照組)共8組，每組12只。注射用燈盞花素組按25 mg·kg-1的劑量(臨床人用劑量的30倍)給藥，陽性藥組給予200 mg·kg-1的血塞通注射液(臨床人用劑量的30倍)，各組均為尾靜脈注射一次給藥，給藥體積0.2 mL/10g，給藥30 min后，用玻璃毛細(xì)管插入小鼠眼內(nèi)眥球后靜脈叢，深約4～5 mm，輕輕轉(zhuǎn)動至有血液流出，于載玻片兩端各滴一滴血，血滴直徑約5 mm，立即用秒表計時，每隔10s用清潔牙簽自血滴邊緣向里輕輕挑動一次，并觀察有無血絲挑起，從計時起至挑起血絲止，所歷時間即為凝血時間。

陽性藥血塞通注射液組及5個批號注射用燈盞花素與陰性組比較凝血時間明顯延長，差異有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義，1個批號注射用燈盞花素與與陰性組比較凝血時間延長，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 注射用燈盞花素對小鼠體內(nèi)血栓的藥效學(xué)研究

表2 注射用燈盞花素凝血時間的藥效學(xué)研究

2.3 小鼠常壓耐缺氧作用[4]取18～20g小鼠96只(雌雄兼有)，按體重隨機(jī)分為陰性組、陽性藥組以及6個批號的注射用燈盞花素組，共8組，每組12只。陰性組給予氯化鈉注射液，陽性藥組給予1.65 mg·kg-1的尼莫地平注射液(臨床人用劑量的25倍)，注射用燈盞花素組按25 mg·kg-1的劑量(臨床人用劑量的30倍)給藥。各組均為尾靜脈注射一次給藥，給藥體積0.2 mL/10g，給藥30 min后，將小鼠放入盛有15 g鈉石灰的廣口瓶內(nèi)(每瓶放1只小鼠)，用凡士林涂抹瓶口蓋嚴(yán)，使之不漏氣，開始計時，以呼吸停止為指標(biāo)，觀察小鼠因缺氧而死亡的時間。

陽性藥組尼莫地平注射液及4個批號注射用燈盞花素與陰性組比較喘息時間明顯延長，差異有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義。2個批號注射用燈盞花素與與陰性組比較喘息時間延長，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 注射用燈盞花素常壓耐缺氧作用的藥效學(xué)研究

3 討論

3.1 中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測定的局限性 生物活性測定法是以藥物的生物效應(yīng)為基礎(chǔ)，以生物統(tǒng)計為工具，運(yùn)用特定的實驗設(shè)計，測定藥物有效性的一種方法，從而達(dá)到控制藥品質(zhì)量的作用，其測定方法包括生物效價測定法和生物活性限值測定法[5]。

中藥的藥材來源廣泛、多變，制備工藝復(fù)雜，使得中藥制劑的質(zhì)量控制相對困難。目前中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測定的建立與研究多半只是對中藥產(chǎn)品成分的穩(wěn)定性和可控性實行改進(jìn)，并沒有與中藥的藥效建立直接的內(nèi)在聯(lián)系[6]。尤其是用于臨床的中藥注射劑和危重病癥治療的中藥制劑，更應(yīng)該保證每批產(chǎn)品具有可靠的生物活性[7]。本研究表明，雖然6批注射用燈盞花素中野黃芩苷含量均符合目前質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，但生物活性測定結(jié)果有所不同，顯示不同的生產(chǎn)工藝或同一企業(yè)不同的原料對中藥注射劑的有效性存在明顯影響。因此單純控制某些指標(biāo)成分的理化分析并不能全面反映中藥注射劑產(chǎn)品的有效性，應(yīng)該結(jié)合“生物活性測定”方法進(jìn)行綜合評價。

3.2 分析結(jié)果和比較方法 本試驗研究根據(jù)《中國藥典》2015年版四部附錄“中藥生物活性測定指導(dǎo)原則”[5]設(shè)計，根據(jù)藥品的功能主治篩選生物活性測定方法。作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的生物活性測定方法，所選擇的檢測指標(biāo)應(yīng)當(dāng)客觀、專屬性強(qiáng)，與功能主治相關(guān)，給藥途徑一般應(yīng)與臨床用藥途徑一致，還應(yīng)當(dāng)操作簡便、成本低廉、檢測指標(biāo)明確、靈敏度高、重現(xiàn)性好[8]。

小鼠體內(nèi)血栓實驗，膠原蛋白和腎上腺素都是血小板聚集誘導(dǎo)劑，小鼠尾靜脈注射后誘發(fā)體內(nèi)肺栓塞，血栓形成，導(dǎo)致偏癱和死亡。6個批號的注射用燈盞花素對血栓混合誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的急性血栓小鼠死亡個數(shù)以及偏癱未恢復(fù)數(shù)(15min內(nèi))減少，說明其對注射血栓混合誘導(dǎo)劑形成體內(nèi)血栓模型的小鼠有一定的保護(hù)作用，但程度各不相同。該實驗中血栓誘導(dǎo)劑膠原蛋白和腎上腺素是微量注射，實際操作時對小鼠尾靜脈注射給藥要求較高，如果漏液實驗結(jié)果易出現(xiàn)偏差。

小鼠常壓耐缺氧實驗，缺氧對機(jī)體是一種劣性刺激，影響機(jī)體各種代謝，特別是影響機(jī)體的氧化供能，最終會導(dǎo)致機(jī)體的心腦等重要器官缺氧供能不足而死亡。野黃芩苷可提高機(jī)體的血氧利用率，降低機(jī)體耗氧量。同時可擴(kuò)張血管(特別是冠脈和軟腦膜血管)[9]，改善微循環(huán)，增加供氧量，從而改善機(jī)體缺氧狀態(tài)，本實驗以小鼠在常壓缺氧條件下呼吸停止死亡為指標(biāo)，研究注射用燈盞花素的耐缺氧作用。該實驗受人為因素影響小且較敏感。

小鼠凝血時間實驗，血瘀癥常有“濃粘凝聚“的血液流變異常，血瘀證患者血液運(yùn)行不暢，易致血栓形成，血管栓塞，燈盞花素能改善血瘀證患者的血液流變性[10]，能夠抑制血小板功能，抑制血小板的粘附聚集和釋放，改善淤血癥高凝狀態(tài)，6個批號的注射用燈盞花素均可不同程度延長小鼠凝血時間，該實驗操作方法簡單易行，不需要復(fù)雜儀器。

綜上所述，篩選出適宜的注射用燈盞花素生物活性測定指標(biāo)為小鼠常壓耐缺氧實驗和小鼠凝血時間實驗。生物活性測定方法的建立作為一項新的內(nèi)容還應(yīng)進(jìn)行方法學(xué)驗證，包括精密度考察、方法適用性考察，如果經(jīng)過驗證，能基本達(dá)到綜合控制與有效性相關(guān)的質(zhì)量指標(biāo)目的，則應(yīng)將“生物活性測定”項目正式收載于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，并在今后的工作中不斷完善提高。