馬家玲，高艷平

(張家港市第一人民醫(yī)院 蘇州大學(xué)附屬?gòu)埣腋坩t(yī)院 麻醉科， 江蘇 張家港 215600)

大腦海馬對(duì)缺血缺氧非常敏感，是大腦缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷的好發(fā)部位之一，而大腦海馬神經(jīng)元受損會(huì)引起認(rèn)知功能障礙，是腦損傷的主要表現(xiàn)之一[1]，故抑制海馬神經(jīng)元受損，是緩解I/R腦損傷的重要手段之一。目前研究發(fā)現(xiàn)，線粒體自噬與腦I/R損傷關(guān)系密切，其自噬不足或過(guò)度激活均可導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞變性和死亡而加重腦損傷[2]。研究證實(shí)miR-183可抑制自噬并刺激細(xì)胞凋亡[3]，且miR-183也可在大腦皮質(zhì)中特異性表達(dá)，并參與神經(jīng)細(xì)胞分化和調(diào)控[4]。但miR-183抑制線粒體抑制自噬對(duì)I/R腦損傷過(guò)程海馬神經(jīng)元的影響，報(bào)道較少。腺病毒基因Bcl-2同源蛋白[B-cell leukemia/lymphoma 2(Bcl-2)/adenovirus E1B interacting protein 3-like，BNIP3L]是介導(dǎo)腦內(nèi)線粒體自噬，減輕腦缺血損傷的必須成分[5]。但Bnip3l與miR-183的靶向作用還尚不清楚，本研究建立雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)對(duì)兩者的靶向作用，進(jìn)行驗(yàn)證，并復(fù)制海馬神經(jīng)元細(xì)胞(HT-22)缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模型來(lái)模擬I/R損傷模型，探討miR-183靶向調(diào)控Bnip3l表達(dá)對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞線粒體自噬的影響及作用機(jī)制，以期闡明I/R腦損傷的分子生物學(xué)機(jī)制，為臨床研究提供可靠資料。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系:小鼠源海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT-22(ATCC：American Type Culture Collection)。

1.1.2 主要試劑:miR-183激動(dòng)劑(miR-183 mimics，Signosis公司)及陰性對(duì)照(miR-183NC)(System Biosciences公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)(Sigma-Aldrich公司)；Trizol試劑盒(北京麥瑞博公司)；反轉(zhuǎn)錄RT試劑盒(武漢純度生物科技有限公司)；DMEM 高糖培養(yǎng)基(Hyclone 公司)；BCA 蛋白定量試劑盒、胰蛋白酶(Pierce 公司)；泛素和LC3結(jié)合蛋白p62(ubiquitin-and LC3-binding protein p62，p62)抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；BNIP3L抗體(武漢菲恩生物科技有限公司)；自噬相關(guān)蛋白beclin-1抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3-Ⅱ)、LC3-I抗體(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 HT-22的分組及處理：收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板上，適應(yīng)性培養(yǎng)24 h后，將其分為對(duì)照組、缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模型(HR)組、miR-183過(guò)表達(dá)組(miR-183 mimics)、陰性對(duì)照(miR-183 NC)組。對(duì)照組細(xì)胞不任何處理，使其自然增值；除對(duì)照組外，其余各組細(xì)胞均按文獻(xiàn)[6-7]方法于3氣培養(yǎng)箱中缺氧3 h，復(fù)氧12 h建立缺氧復(fù)氧模型，miR-183 mimics組和miR-183 NC組分別在缺氧3 h后轉(zhuǎn)染miR-183 mimics和miR-183 NC試劑，轉(zhuǎn)染后進(jìn)行復(fù)氧12 h培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染方法嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。各組細(xì)胞按上述方法處理后，收集細(xì)胞，以備后續(xù)試驗(yàn)。將新購(gòu)的HT-22細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于條件為 37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，當(dāng)細(xì)胞匯合度>80%后，進(jìn)行常規(guī)傳代、計(jì)數(shù)。

1.2.2 MTT法測(cè)定HT-22細(xì)胞存活率：取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，向每個(gè)孔中加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，隨后在37 ℃下再孵育1 h，小心丟棄含有MTT溶液的培養(yǎng)基，并加入200 μL二甲基亞砜(DMSO)以溶解沉淀物。使用自動(dòng)多孔分光光度計(jì)測(cè)量490 nm的吸光度(A)值，存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。

1.2.3 透射電鏡觀察線粒體結(jié)構(gòu)：細(xì)胞按文獻(xiàn)[7]方法加入5 mL 2.5%戊二醛固定、磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，用l%四氧化鋨在4 ℃下固定30 min、PBS洗滌后，用2%醋酸鈾水溶液染色30 min、乙醇梯度脫水，3 mL純丙酮-EPON812包埋后，于37、45、60 ℃烘箱內(nèi)烘烤固化后，切成1 μm切片，2%醋酸鈾染色并切成50 nm超薄切片，用醋酸-檸檬酸染色后于JEM-1200EX透射電鏡下觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)。

1.2.4 RT-qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞miR-183、Bnip3l mRNA相對(duì)表達(dá)水平：利用Trizol試劑盒抽提細(xì)胞總RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系為10 μL(2 μL 5× reaction mix，1 μL random primer，0.5 μL反轉(zhuǎn)錄酶，5 μL RNA樣品)，反應(yīng)條件(置于42 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶活性)。將cDNA稀釋10倍進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為cDNA 4 μL，正向引物、反向引物各0.4 μL，SYBR Green/Flourescein qPCR Maxter Mix 10 μL，去離子水5.2 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)熱3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，上述3步驟35次循環(huán)，72 ℃ 5 min終止反應(yīng)。miR-183以U6為內(nèi)參基因，Bnip3l mRNA以β-actin為內(nèi)參基因，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成設(shè)計(jì)(表1)。用2-ΔΔCt算法計(jì)算miR-183、Bnip3l mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 RT-qPCR primer sequences

1.2.5 Western blot檢測(cè)BNIP3L、beclin-1、p62、LC3-Ⅱ/ LC3Ⅰ蛋白表達(dá)：取各組細(xì)胞，加細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，離心分離后，取上清液提取蛋白，按BCA試劑盒說(shuō)明書測(cè)定蛋白濃度，并灌制SDS-PAGE凝膠后，取200 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，接著將全部蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，并置于5%的脫脂奶粉溶液中，于搖床上37 ℃封閉2 h，將目的蛋白條帶，置于孵育盒中，加入抗體(BNIP3L、 beclin-1、p62、LC3-Ⅱ、 LC3-Ⅰ，β-actin(內(nèi)參)，1∶1 000、1∶500、1∶1 000、1∶1 000，1∶2 000)于4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜，經(jīng)TBST漂洗3次，加入1∶1 000的羊抗兔二抗溶液，于搖床上室溫孵育2 h，經(jīng)TBST再次漂洗3次，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并以Image-J軟件分析各組蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)：合成Bnip3l的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)的miR-183識(shí)別序列，克隆至pmiRGlo載體，得到pmiRGlo-Bnip3l-3′UTR-WT。另外對(duì)miR-183識(shí)別區(qū)Bnip3l堿基進(jìn)行突變連接至pmiRGlo載體，得到得到pmiRGlo-Bnip3l-3′UTR-MUT，分別將pmiRGlo-Bnip3l-3′UTR-WT、pmiRGlo-Bnip3l-3′UTR-MUT質(zhì)粒與miR-183 NC、miR-183 mimics共轉(zhuǎn)染，分為miR-183NC+Bnip3l-3′UTR-WT組、miR-183 mimics+Bnip3l-3′UTR-WT組、miR-183NC+Bnip3l-3′UTR-MUT組、miR-183 mimics+Bnip3l-3′UTR-MUT組，24 h后按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書添加螢火蟲和海參熒光素酶試劑上機(jī)檢測(cè)。每孔的數(shù)值以螢火蟲熒光活性/海參熒光活性顯示，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組HT-22細(xì)胞存活率比較

與對(duì)照組相比，HR組和miR-183 NC組細(xì)胞存活率均下降(P<0.05)，與HR組和miR-183 NC組相比，miR-183 mimics組細(xì)胞存活率降低(P<0.05)(表2)。

表2 各組HT-22細(xì)胞存活率比較Table 2 Comparison of survival rate of HT-22 cells

2.2 各組HT-22細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)觀察

對(duì)照組細(xì)胞核仁明顯，線粒體結(jié)構(gòu)清晰，核糖體豐富；HR組和miR-183 NC組核仁消失，膜狀結(jié)構(gòu)自噬體增多，可見線粒體自噬及自噬后殘留的黑色素；miR-183 mimics組細(xì)胞核固縮，膜狀結(jié)構(gòu)自噬體較少，線粒體結(jié)構(gòu)紊亂，甚至模糊(圖1)。

圖1 透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)Fig 1 Ultrastructure of mitochondria observed by transmission electron microscope (×2 500)

2.3 各組HT-22細(xì)胞miR-183、Bnip3l mRNA表達(dá)水平

與對(duì)照組相比，HR組和miR-183 NC組細(xì)胞miR-183表達(dá)下降(P<0.05)，Bnip3l mRNA表達(dá)升高(P<0.05)；與HR組和miR-183 NC組相比，miR-183 mimics組細(xì)胞miR-183 表達(dá)升高(P<0.05)，Bnip3l mRNA表達(dá)降低(P<0.05)(表3)。

表3 各組HT-22細(xì)胞miR-183、Bnip3l mRNA相對(duì)表達(dá)水平Table 3 Relative expression levels of mir-183 and Bnip3l mRNA in HT-22 cells of each n=6)

2.4 各組HT-22細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白BNIP3L、beclin-1、p62、LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ相對(duì)表達(dá)水平

與對(duì)照組相比，HR組和miR-183 NC組細(xì)胞BNIP3L、beclin-1、LC3-Ⅱ/ LC3Ⅰ表達(dá)升高(P<0.05)，p62表達(dá)下降(P<0.05)；與HR組和miR-183 NC組相比，miR-183 mimics組細(xì)胞BNIP3L、beclin-1、LC3-Ⅱ/ LC3Ⅰ表達(dá)下降(P<0.05)，p62表達(dá)升高(P<0.05)(圖2，表4)。

圖2 Western blot檢測(cè)各組HT-22細(xì)胞BNIP3L、beclin-1、p62、LC3-Ⅱ/ LC3Ⅰ蛋白表達(dá)Fig 2 Western blot of BNIP3L, beclin-1, p62,LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ protein expression in HT-22 cells of each group

表4 各組細(xì)胞BNIP3L、beclin-1、p62、LC3-Ⅱ/ LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平Table 4 Protein expression levels of BNIP3L, beclin-1, p62, LC3-Ⅱ/ LC3Ⅰ in each n=6)

2.5 雙熒光素酶法檢測(cè)miR-183與Bnip3l關(guān)系

miRtarbase預(yù)測(cè)顯示，miR-183與Bnip3lmRNA 3′UTR區(qū)域有結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示，與miR-183+Bnip3l-3′UTR-WT組比較，miR-183 mimics+Bnip3l-3′UTR-WT組熒光素酶活性降低(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with miR-183NC+Bnip3l-3′UTR-WT圖3 miRtarbase預(yù)測(cè)miR-183與Bnip3l的靶向關(guān)系及雙熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果Fig 3 Prediction of targeting relationship between miR-183 and Bnip3l by miRtarbase and analysis of dual-luciferase reporter gene

3 討論

I/R損傷引起的腦損傷，是導(dǎo)致成年人致死和致殘的主要原因之一，其病理和生理過(guò)程復(fù)雜，涉及神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡、自噬、炎性反應(yīng)、修復(fù)等過(guò)程。體外培養(yǎng)經(jīng)過(guò)永生化處理的海馬神經(jīng)元HT-22細(xì)胞并建立缺氧/復(fù)氧(H/R)模型，可直接觀察細(xì)胞形態(tài)并監(jiān)測(cè)其生理、生化、代謝等功能的改變，是研究I/R損傷體外細(xì)胞水平的最佳手段[8]。

在短暫全腦缺血/再灌注后海馬錐體神經(jīng)元上可觀察到自噬空泡等自噬現(xiàn)象[9]，研究證實(shí)，在腦損傷初期，自噬激活對(duì)低氧引起的腦缺血神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用[10]，氧糖剝奪2 h后，用自噬抑制劑抑制自噬可加重腦損傷，反之用雷帕霉素誘導(dǎo)自噬可減少神經(jīng)元凋亡緩解腦損傷[11]，另外在氧糖剝奪6 h后用自噬抑制劑處理可緩解腦損傷，而用自噬激活劑處理，神經(jīng)元及腦損傷反而加重，表明在腦損傷初期抑制自噬可加重神經(jīng)元和腦損傷，而在腦損傷后期抑制自噬可減緩腦損傷。本研究用氧糖剝奪3 h后復(fù)氧6 h處理HT-22神經(jīng)元細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HR組HT-22細(xì)胞存活率低于對(duì)照組，電鏡下觀察可見線粒體自噬及自噬后殘留的黑色素、膜狀結(jié)構(gòu)自噬體等均增多，提示缺氧3 h/復(fù)氧12 h神經(jīng)元細(xì)胞中線粒體自噬被激活。miR-183能夠抑制自噬，且在人大腦皮質(zhì)中有特異性表達(dá)，并參與神經(jīng)細(xì)胞分化和調(diào)控[12]，本研究在HR組缺氧/復(fù)氧HT-22細(xì)胞中也檢測(cè)到miR-183的表達(dá)，且miR-183的表達(dá)低于對(duì)照組，提示缺氧3 h復(fù)氧12 h后，自噬激活，miR-183表達(dá)降低，表明miR-183低表達(dá)參與神經(jīng)元細(xì)胞自噬激活過(guò)程。又有研究證實(shí)miR-183過(guò)表達(dá)可抑制細(xì)胞的自噬，促進(jìn)凋亡[4]。本研究過(guò)表達(dá)miR-183后，發(fā)現(xiàn)miR-183 mimics組miR-183增高后，HT-22存活率低于HR組，電鏡下觀察可見，膜狀結(jié)構(gòu)自噬體減少，線粒體出現(xiàn)結(jié)構(gòu)紊亂、甚至模糊等損傷現(xiàn)象，表明過(guò)表達(dá)miR-183可抑制缺氧3 h復(fù)氧12 h神經(jīng)細(xì)胞線粒體自噬和細(xì)胞生存。

BNIP3L位于線粒體外膜，低氧刺激下BNIP3L表達(dá)升高，可促進(jìn)Beclin-1蛋白的游離釋放，并調(diào)控下游多種自噬相關(guān)Atg蛋白在自噬前體結(jié)構(gòu)中的定位，從而激活線粒體自噬的發(fā)生[13]，另外，BNIP3L也可與自噬相關(guān)基因Atg8相似同源物L(fēng)C3和p62結(jié)合并介導(dǎo)自噬體靶向清除損傷的線粒體[14]。如發(fā)現(xiàn)BNIP3L也是介導(dǎo)缺血腦內(nèi)線粒體自噬發(fā)生所必須的成分，其缺失會(huì)導(dǎo)致線粒體自噬障礙，而逆轉(zhuǎn)其缺失可發(fā)揮抗腦缺血損傷，表明Bnip3l也可參與線粒體自噬過(guò)程，且與腦I/R再損傷關(guān)系密切[15]。本研究發(fā)現(xiàn)HR組HT-22細(xì)胞Bnip3l mRNA及蛋白、自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達(dá)和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均高于對(duì)照組，p62表達(dá)低于對(duì)照組，提示缺氧3 h復(fù)氧12 h神經(jīng)細(xì)胞，Bnip3l高表達(dá)可能與自噬激活有關(guān)。而過(guò)表達(dá)miR-183抑制自噬激活后，miR-183 mimics組Bnip3l mRNA及通路相關(guān)蛋白、細(xì)胞存活率均明顯低于HR組，提示miR-183高表達(dá)后，細(xì)胞生存率降低，BNIP3L及缺線粒體自噬均處于抑制狀態(tài)，表明過(guò)表達(dá)miR-183后，可能抑制了BNIP3L介導(dǎo)的線粒體自噬激活，而使缺氧3 h復(fù)氧12 h神經(jīng)細(xì)胞損傷加重，miR-183與Bnip3l之間可能存在靶向關(guān)系。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一推測(cè)，本研究采用雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-183 mimics與WT-Bnip3l后，雙熒光素酶活性明顯抑制，表明miR-183與Bnip3l存在靶向調(diào)控關(guān)系。

綜上所述，miR-183過(guò)表達(dá)可靶向抑制Bnip3lmRNA表達(dá)，抑制HT-22細(xì)胞線粒體自噬，加重缺氧/復(fù)氧所致HT-22細(xì)胞損傷。該結(jié)果為臨床診斷和治療缺血腦損傷提供一定的參考。但本研究也存在一定的不足，細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)具有一定的差異性，線粒體自噬是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，在缺氧/復(fù)氧后期miR-183調(diào)控BNIP3L介導(dǎo)線粒體自噬與腦損傷的關(guān)系還未驗(yàn)證，這有待后續(xù)進(jìn)一步研究。