程雪婷， 羅和生， 占 婷， 萬一圓， 陳小麗， 黃曉東

1.武漢大學中南醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 武漢 430071；2.武漢大學人民醫(yī)院消化內(nèi)科；3.武漢市第三醫(yī)院(武漢大學附屬同仁醫(yī)院)消化內(nèi)科

結(jié)直腸癌是一種對人體健康危害極大的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計，2015年我國城鄉(xiāng)居民的大腸癌發(fā)病率在所有腫瘤中居第3位，死亡率居第5位[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長18～25個核苷酸的單鏈非編碼RNA，通過直接與mRNA的3’非編碼區(qū)(3’-untranslated region，3’UTR)特定區(qū)域結(jié)合調(diào)控基因表達。miRNA在許多腫瘤中發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用。許多研究表明，miR-574-3p可參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖[2]、凋亡[3]、遷移、侵襲[4]、腫瘤放化療耐藥[5]等生物學行為。Jin等[6]發(fā)現(xiàn)，過表達miR-574-3p可以抑制食管癌細胞的增殖、侵襲。Xin等[7]發(fā)現(xiàn)，circRNA_100782可以與miR-574-3p結(jié)合來調(diào)節(jié)Rb基因的表達從而影響胃癌細胞的增殖和侵襲能力。Della等[8]在對結(jié)直腸癌患者的石蠟包埋材料進行miRNA芯片分析發(fā)現(xiàn)，miR-574-3p在腫瘤組織標本中的表達顯著低于配對的正常組織。然而，目前尚不清楚miR-574-3p是否參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究通過檢測結(jié)直腸癌患者組織和結(jié)直腸癌細胞系中miR-574-3p的表達情況，探索它在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床標本收集收集人結(jié)直腸癌組織及對應(yīng)癌旁組織11對，癌旁組織距離癌灶邊界≥5 cm。樣本來源于2019年4月至2019年12月武漢市第三醫(yī)院胃腸外科行結(jié)直腸癌手術(shù)的患者。男5例，女6例，年齡45～66歲，平均年齡54歲。所有標本離體后立即用RNA保存液浸泡，置于4 ℃冰箱過夜，-80 ℃長期保存。經(jīng)術(shù)后病理檢查，均為結(jié)直腸癌。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(武三醫(yī)倫KY2019-012)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 結(jié)直腸癌細胞株人結(jié)直腸癌細胞株SW480、HCT-116、HCT-8均購自美國典藏細胞庫(ATCC)。人原代結(jié)腸黏膜上皮細胞(HUM-d010)購自賽百慷(上海)公司。其中SW480細胞用不透氣培養(yǎng)瓶及L-15培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。HCT-116培養(yǎng)于McCOY’5A培養(yǎng)基，HCT-8培養(yǎng)于RIPA 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃，體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。HUM-d010用原代上皮細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有培養(yǎng)基中均加入質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清及質(zhì)量濃度為10 g/L的青-鏈霉素制成的完全培養(yǎng)基。

1.3 主要試劑和儀器L-15培養(yǎng)基、RIPA 1640培養(yǎng)基、McCOY’5A培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、轉(zhuǎn)染用OPTI-MEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；人原代結(jié)腸黏膜上皮細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自賽百慷(上海)公司。miR-574-3p及U6引物、miR-574-3p mimic及相應(yīng)對照mimic NC均購自銳博(廣州)公司；RNA提取試劑TRIzol，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000購自Invitrogen(美國)公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TOYOBO(日本)公司；熒光定量PCR試劑盒購自康為世紀(北京)公司；CCK-8試劑盒購自美侖(大連)公司；EdU-488細胞增殖檢測試劑盒購自碧云天(上海)公司；細胞周期和凋亡檢測試劑盒購自聯(lián)科(杭州)公司。熒光定量PCR擴增儀(BIO-RAD)購自美國伯樂公司。熒光倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.4 檢測方法

1.4.1 qRT-PCR檢測miR-574-3p的表達：組織及細胞總RNA提取參照TRIzol試劑說明書進行。采用超微量紫外可見分光光度計檢測RNA純度和濃度，確保OD260/280在1.8左右，OD260/230為1.8～2.0，否則視為質(zhì)量不合格的RNA。將質(zhì)量合格的總RNA與逆轉(zhuǎn)錄試劑及特異性的miR-574-3p逆轉(zhuǎn)錄引物(U6作為內(nèi)參)混合，反應(yīng)體系如下：1 200 ng RNA用無RNA酶水補足至14 μl，特異性的逆轉(zhuǎn)錄引物1 μl，EnzymeMix 1 μl，5×Reaction buffer 4 μl，在20 μl反應(yīng)體系中，37 ℃ 15 min，100 ℃ 5 min進行逆轉(zhuǎn)。取4 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA與10 μl UltraSBR Mixture，miR-574-3p引物2 μl，4 μl ddH2O混合，在20 μl反應(yīng)體系中，95 ℃變性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環(huán)，U6作為內(nèi)參，miR-574-3p的相對表達量在組織中用2-ΔCt(以癌組織的表達量作為對照)計算，結(jié)直腸癌細胞系中用2-ΔΔCt(以HUM-d010細胞的表達量作為對照)計算。

1.4.2 結(jié)直腸癌細胞轉(zhuǎn)染效果檢測：取對數(shù)生長細胞HCT-8和HCT-116進行鋪板，待細胞密度達80%融合后，按照Lipofectamine3000說明書將miR-574-3p mimic及相應(yīng)對照mimic NC分別轉(zhuǎn)染入孔板內(nèi)，48 h后提取總RNA，進行熒光定量PCR擴增，檢測結(jié)直腸癌細胞中miR-574-3p的mRNA表達水平。

1.4.3 CCK-8檢測：細胞轉(zhuǎn)染24 h后，將孔板內(nèi)細胞用胰酶消化下來，在倒置顯微鏡下用細胞計數(shù)板進行計數(shù)，按6 000個細胞/孔在96孔板中接種細胞懸液(100 μl/孔)，每組設(shè)5個副孔，24 h后向每孔加入CCK-8溶液10 μl(注意不要在孔內(nèi)生成氣泡)，將培養(yǎng)板置于37 ℃，體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h后，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度值，記為第1天，在同一時間連續(xù)監(jiān)測3 d。

1.4.4 EdU檢測細胞的增殖能力：細胞轉(zhuǎn)染24 h后，將孔板細胞用胰酶消化下來，按8 000個細胞/孔在96孔板中接種細胞懸液(100 μl/孔)，每組設(shè)3個副孔。24 h后棄培養(yǎng)基，向每孔加入100 μl 37 ℃預(yù)熱的2×EdU工作液(20 μm)和培養(yǎng)液的等體積混合液(用細胞完全培養(yǎng)基按500∶1稀釋EdU(10 μm)可得2×EdU工作液)，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h；EdU標記細胞完成后，去除培養(yǎng)液，加入100 μl固定液(4%多聚甲醛)，去除固定液，每孔用洗滌液(含3% BSA的PBS)洗滌3次，每次3～5 min，去除洗滌液，每孔用100 μl通透液(含0.3% Triton X-100的PBS)，室溫孵育10～15 min，去除通透液，每孔用100 μl洗滌液洗滌細胞1～2次，每次3～5 min，按照EdU-488細胞增殖檢測試劑盒(上海碧云天)說明書推薦比例配制Click反應(yīng)液，去除洗滌液，每孔加入Click反應(yīng)液100 μl，室溫避光孵育30 min，吸除Click反應(yīng)液，洗滌液洗滌3次，每次3～5 min，可于熒光顯微鏡下觀察，增殖細胞被標記了明亮綠色熒光。

1.4.5 克隆形成實驗：細胞轉(zhuǎn)染24 h后，將HCT-8和HCT-116兩種細胞種植到6孔板中(每孔500個細胞)，持續(xù)培養(yǎng)14 d，棄上清，將可見克隆用PBS洗滌2次(避免克隆脫落)，用4%多聚甲醛(5 ml/孔)，固定15 min，然后去除多聚甲醛固定液，適量1%結(jié)晶紫染色液染色20 min，結(jié)束后，清水洗滌培養(yǎng)板，晾干。肉眼或低倍鏡下計數(shù)并拍照。

1.4.6 細胞凋亡檢測：本實驗采用Annexin V-FITC/PI雙染色法。將HCT-8和HCT-116兩種細胞分別分為NC組和mimic組。細胞轉(zhuǎn)染48 h后，將其用胰酶消化收集至EP管中，800 r/min，離心5 min，收集細胞，棄培養(yǎng)基。用預(yù)冷PBS清洗細胞2次，800 r/min，離心5 min，收集細胞，棄上清。將細胞重懸于500 μl 1×Binding Buffer中，加入5 μl Annexin-V FITC和10 μl PI，混勻，室溫避光孵育5 min，之后進行流式細胞術(shù)檢測，1 h內(nèi)完成上機檢測。

1.4.7 細胞周期檢測：細胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集2×105～1×106個細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清。用PBS洗滌1次，離心棄上清。加入1 ml DNA著色液和10 μl通透液，渦旋振蕩5～10 s,混勻。室溫避光孵育30 min，之后進行流式細胞術(shù)檢測，1 h內(nèi)完成上機檢測。

2 結(jié)果

2.1 miR-574-3p在結(jié)直腸癌組織及結(jié)直腸癌細胞系中低表達qRT-PCR結(jié)果顯示：miR-574-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達低于配對的癌旁組織(P<0.001)(見圖1A)。相較于HUM-d010，miR-574-3p的表達在3種結(jié)直腸癌細胞系中均下調(diào)(見圖1B)(P<0.05)。

注：**P<0.01，***P<0.001。

2.2 結(jié)直腸癌細胞的轉(zhuǎn)染效果檢測對HCT-116和HCT-8細胞進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染mimic NC的細胞稱為NC組，轉(zhuǎn)染miR-574-3p mimic的細胞稱為mimic組。各組均進行qRT-PCR檢測，結(jié)果顯示，miR-574-3p mimic組的miR-574-3p表達水平均高于NC組，其中HCT-8細胞表達水平升高322.8倍(P<0.05)(見圖2A)，HCT-116細胞的表達水平升高409.2倍(P<0.05)(見圖2B)。表明兩種結(jié)直腸癌細胞轉(zhuǎn)染miR-574-3p mimic后分別顯著上調(diào)了miR-574-3p的表達水平。

注：*P<0.05。

2.3 miR-574-3p抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖能力

2.3.1 CCK-8法繪制HCT-116、HCT-8細胞生長曲線：在HCT-116、HCT-8中，miR-574-3p mimic相比于NC組的細胞增殖速度在第2天開始明顯減弱，在第3天增殖速度的抑制能力得到增強，增殖能力差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖3)。

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.3.2 克隆形成實驗結(jié)果：miR-574-3p mimic組克隆形成數(shù)少于NC組(見圖4A)。結(jié)果表明：在HCT-116、HCT-8中，過表達miR-574-3p mimic的細胞增殖速度減弱，增殖能力差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖4B～4C)。

注：*P<0.05，**P<0.01。

2.3.3 EdU細胞成像實驗結(jié)果：帶綠色熒光的為增殖細胞，miR-574-3p mimic組的增殖細胞少于NC組(見圖5A)，結(jié)果表明，在HCT-116、HCT-8中，miR-574-3p mimic組相比于NC組的細胞增殖數(shù)量減少，增殖能力差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖5B～5C)。

注：*P<0.05。

2.4 miR-574-3p促進HCT-116、HCT-8細胞凋亡在HCT-116、HCT-8中，miR-574-3p mimic組相比于NC組細胞，細胞凋亡數(shù)量增加(P<0.05)(見圖6)。提示miR-574-3p可以促進HCT-116和HCT-8細胞凋亡。

注：*P<0.05，***P<0.001。

2.5 miR-574-3p使HCT-116、HCT-8的細胞周期發(fā)生變化在HCT-116、HCT-8中，miR-574-3p mimic組相比于NC組細胞，細胞的G0/G1期比例上升，G2期比例下降(P<0.05)(見圖7)。提示miR-574-3p可以影響結(jié)直腸癌細胞周期，使細胞發(fā)生G0/G1期阻滯，G2期減少。

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3 討論

miRNA介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生過程，包括炎癥、細胞周期、分化、凋亡、遷移、侵襲等，其異常表達可能與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。我們的研究顯示，miR-574-3p在結(jié)直腸癌組織和結(jié)直腸癌細胞系中均下調(diào)，過表達miR-574-3p可抑制人結(jié)直腸癌細胞的體外增殖，促進其凋亡，使其發(fā)生G0/G1期阻滯。這表明miR-574-3p可能作為抑癌基因參與結(jié)直腸癌的進展。

目前結(jié)直腸癌的篩查方法很有限，糞便潛血實驗和糞便常規(guī)檢查對于診斷結(jié)直腸癌的癌前病變靈敏性較低，此外，常用于診斷結(jié)直腸癌的血清生物標志物是CEA和CA199，其診斷的特異性和靈敏性均較低。由于缺乏理想的無創(chuàng)診斷方法，以及中晚期才出現(xiàn)臨床表現(xiàn)，導(dǎo)致許多結(jié)直腸癌患者在相對較晚的時間被確診，這是結(jié)直腸癌患者死亡率較高的原因之一。因此，臨床上迫切需要發(fā)現(xiàn)可用于結(jié)直腸癌篩查、診斷和預(yù)后判斷的分子標志物。結(jié)直腸癌患者糞便、血清以及腫瘤樣本中的表達異常的miRNA可能作為潛在的無創(chuàng)診斷結(jié)直腸癌的分子標志物在結(jié)直腸癌篩查診斷、預(yù)后判斷中發(fā)揮作用。Wu等[9]發(fā)現(xiàn)，與正常患者相比較，miR-21和miR-92a在結(jié)直腸癌患者的糞便中表達上調(diào)，在診斷結(jié)直腸癌中表現(xiàn)出較好的特異性和靈敏性。Hur等[10]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者的血清miR-203水平顯著上調(diào)且miR-203高表達患者的腫瘤轉(zhuǎn)移率更高、生存率更低，表明miR-203是可用于預(yù)后和轉(zhuǎn)移預(yù)測的潛在生物標志物?；谝陨蠄蟮溃覀冞€將進一步研究miR-574-3p在血漿和糞便樣本中的表達水平，以及其與結(jié)直腸癌腫瘤分期與轉(zhuǎn)移的關(guān)系，評估m(xù)iR-574-3p在診斷和預(yù)后判斷中的價值，以期為臨床診斷和治療帶來新的思路。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，miR-574-3p在結(jié)直腸癌組織和細胞系中均低表達，過表達miR-574-3p可抑制結(jié)直腸癌細胞增殖、促凋亡，使細胞發(fā)生G0/G1期阻滯。然而關(guān)于miR-574-3p在血清和糞便標本中的表達情況，以及其與腫瘤分期和預(yù)后的關(guān)系有待進一步研究。