謝瑞華， 季紅莉， 付萬(wàn)發(fā)

北京老年醫(yī)院消化科，北京 100095

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及病死率隨著人口老齡化加劇、人們膳食結(jié)構(gòu)變化而呈逐年上升趨勢(shì)[1]。結(jié)直腸癌腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的重要原因，雖然其診斷及治療技術(shù)不斷提高，但臨床分期較晚的患者預(yù)后仍然較差[2]。因此，探索結(jié)直腸癌相關(guān)生物分子是結(jié)直腸癌研究的重要內(nèi)容。人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒-H長(zhǎng)末端重復(fù)關(guān)聯(lián)蛋白2(human endogenous retrovirus-H long terminal repeat-associating protein 2，HHLA2)屬于B7家族，是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的B7家族免疫檢查點(diǎn)分子成員，是腫瘤免疫治療的靶點(diǎn)[3]?？缒ず兔庖咔虻鞍捉Y(jié)構(gòu)域2(transmembrane and immunoglobulin domain containing 2，TMIGD2)是HHLA2的一個(gè)受體，與腫瘤密切相關(guān)[4]。孫琦等[5]研究表明，HHLA2、TMIGD2相互結(jié)合可促進(jìn)腫瘤免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，HHLA2/TMIGD2有望成為腫瘤治療新的通路和靶點(diǎn)。研究表明，程序性死亡因子1(PD-1)及其配體(PD-L1)與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而HHLA2分子結(jié)構(gòu)與PD-L1有一定的同源性和相似性[5-6]。因此,推測(cè)HHLA2、TMIGD2可能對(duì)結(jié)直腸癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有重要作用。然而HHLA2、TMIGD2與結(jié)直腸癌的關(guān)系有待進(jìn)一步探究。因此，本研究通過(guò)探討HHLA2、TMIGD2表達(dá)水平與結(jié)直腸癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，旨在為結(jié)直腸癌的治療進(jìn)展提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2016年10月至2017年10月于本院住院治療的168例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織標(biāo)本作為結(jié)直腸癌組，年齡(60.24±9.21)歲(42～76歲)，男82例，女86例；選取結(jié)直腸癌患者相應(yīng)癌旁正常組織作為對(duì)照組。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查確診[7]；(2)病理組織標(biāo)本及臨床資料保留完整者；(3)術(shù)前未進(jìn)行過(guò)放、化療等治療者；(4)經(jīng)本院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均為自愿參加；(5)腫瘤遠(yuǎn)端距離肛緣≤10 cm者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有其他嚴(yán)重心、肝、腎等器質(zhì)性病變或惡性腫瘤者；(2)有家族性息肉病、炎癥性腸病等結(jié)腸病變者；(3)哺乳期、妊娠期婦女；(4)有細(xì)胞分子靶向治療史者。

收集并整理所有受試者一般臨床資料，主要包括性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤直徑、腫瘤浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Duke分期、腫瘤分化程度。

1.2 主要試劑與儀器HHLA2抗體(貨號(hào)：ATA30617)購(gòu)自武漢益普生物科技有限公司；TMIGD2抗體(貨號(hào)：H00126259-B01P)購(gòu)自上?？泼羯锟萍加邢薰?；免疫組化試劑盒(貨號(hào)：11719386001)購(gòu)自德國(guó)羅氏公司。光學(xué)顯微鏡(型號(hào)：CX23)購(gòu)自日本OLYMPUS公司

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集及保存：采集結(jié)直腸癌患者手術(shù)時(shí)腫瘤組織及其癌旁正常組織。所有組織標(biāo)本做相應(yīng)處理，包括4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、連續(xù)切片，置于-80 ℃保存待測(cè)。

1.3.2 HHLA2、TMIGD2蛋白水平測(cè)定：采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)組織HHLA2、TMIGD2蛋白表達(dá)水平，具體操作方法按照免疫組化試劑盒說(shuō)明書操作。結(jié)果隨機(jī)選5個(gè)高倍鏡視野觀察，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分比作為陽(yáng)性細(xì)胞比例。采用半定量法進(jìn)行評(píng)分[8]，首先按染色強(qiáng)度計(jì)分：棕褐色為3分，棕黃色為2分，淺黃色為1分，無(wú)色為0分；之后按照陽(yáng)性細(xì)胞比例計(jì)分，陽(yáng)性細(xì)胞比例1/3以下為1分，1/3～2/3為2分，2/3以上為3分。兩次評(píng)分乘積為最終得分，≤2分為陰性表達(dá)，>2分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3.3 隨訪：手術(shù)后3年內(nèi)對(duì)所有患者采用電話、入戶和患者入院復(fù)查等方式進(jìn)行隨訪，術(shù)后平均每3～6個(gè)月隨訪1次。其生存期從手術(shù)之日起計(jì)算，隨訪截至2020年10月。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)/%表示，組間比較行卡方檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法分析結(jié)直腸癌患者HHLA2、TMIGD2表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，用Log-Rank對(duì)生存曲線進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)；采用多因素Cox回歸分析影響結(jié)直腸癌預(yù)后的因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組和結(jié)直腸癌組HHLA2、TMIGD2表達(dá)水平比較結(jié)直腸癌組HHLA2、TMIGD2陽(yáng)性表達(dá)率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表1)。免疫組化分析顯示，HHLA2、TMIGD2在結(jié)直腸癌組織中均主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中(見(jiàn)圖1)。

表1 對(duì)照組與結(jié)直腸癌組HHLA2、TMIGD2表達(dá)水平比較[例數(shù)(%)]Tab 1 Comparison of HHLA2 expression and TMIGD2 expression levels between control group and colorectal cancer group[n(%)]

圖1 結(jié)直腸癌患者癌組織中HHLA2(A)、TMIGD2(B)表達(dá)(200×)

2.2 結(jié)直腸癌患者HHLA2、TMIGD2表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系根據(jù)結(jié)直腸癌患者腫瘤組織HHLA2、TMIGD2陽(yáng)性表達(dá)情況，將其分為HHLA2陰性表達(dá)組(58例)、HHLA2陽(yáng)性表達(dá)組(110例)，TMIGD2陰性表達(dá)組(72例)、TMIGD2陽(yáng)性表達(dá)組(96例)。結(jié)果顯示，HHLA2、TMIGD2陽(yáng)性表達(dá)組與陰性表達(dá)組性別、年齡、腫瘤位置比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；HHLA2、TMIGD2陽(yáng)性表達(dá)組與陰性表達(dá)組腫瘤直徑、腫瘤浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Duke分期、腫瘤分化程度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 結(jié)直腸癌患者HHLA2、TMIGD2表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系[例數(shù)(%)]

2.3 結(jié)直腸癌患者HHLA2、TMIGD2表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系采用Kaplan-Meier法分析結(jié)直腸癌患者HHLA2、TMIGD2表達(dá)水平與患者3年生存率的關(guān)系，結(jié)果顯示,HHLA2陰性表達(dá)的結(jié)直腸癌患者3年生存率(84.48%)高于HHLA2陽(yáng)性表達(dá)患者(61.82%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.227，P<0.05)；TMIGD2陰性表達(dá)結(jié)直腸癌患者3年生存率(80.56%)高于TMIGD2陽(yáng)性表達(dá)患者(61.46%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.097，P<0.05)(見(jiàn)圖2～3)。

圖2 結(jié)腸直癌患者HHLA2表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系;圖3 結(jié)腸直癌患者TMIGD2表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

2.4 影響結(jié)直腸癌預(yù)后的多因素Cox回歸分析將結(jié)直腸癌患者是否發(fā)生死亡作為因變量，以HHLA2、TMIGD2、腫瘤直徑、腫瘤浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Duke分期、腫瘤分化程度為自變量進(jìn)行多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示，HHLA2、TMIGD2、Duke分期是影響結(jié)直腸癌死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 影響結(jié)直腸癌預(yù)后的多因素Cox回歸分析

3 討論

結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制仍不十分明確，其發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)基因的表達(dá)失調(diào)或功能異常[9]。如何早期診斷以及預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌不良預(yù)后，盡早采取干預(yù)措施，對(duì)降低患者死亡率至關(guān)重要[10]。臨床研究表明，腫瘤直徑、腫瘤位置、Duke分期、腫瘤分化程度等臨床病理特征均是結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及造成患者死亡的重要影響因素[11]。因此，探索與臨床病理特征及預(yù)后相關(guān)的新分子標(biāo)志物對(duì)結(jié)直腸癌早期干預(yù)、預(yù)后改善具有重要意義。

B7家族中許多成員已作為免疫檢查點(diǎn)用于癌癥的免疫治療[12]。HHLA2作為B7家族重要成員，可與T細(xì)胞表面受體相互作用，在腫瘤微環(huán)境中可能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)機(jī)制[13]。HHLA2僅在一些組織的上皮細(xì)胞中表達(dá)，且在骨肉瘤、肺癌以及乳腺癌等多種癌癥中高表達(dá)，其可能成為腫瘤相關(guān)治療靶點(diǎn)[14]。TMIGD2是HHLA2的受體之一，廣泛存在于B細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞中[15]。本研究結(jié)果中，HHLA2、TMIGD2在結(jié)直腸癌中均呈高表達(dá)。推測(cè)病理狀態(tài)下，HHLA2、TMIGD2表達(dá)水平升高，而二者與免疫抑制作用密切相關(guān)，導(dǎo)致患者免疫功能下降，病情進(jìn)一步惡化。孫琦等[5]研究顯示，HHLA2與TMIGD2結(jié)合可促進(jìn)腫瘤免疫逃逸，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移。本研究中腫瘤直徑≥5 cm、腫瘤浸潤(rùn)程度T4、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Duke分期為Ⅲ期及Ⅳ期、腫瘤呈低分化的結(jié)直腸癌患者HHLA2、TMIGD2陽(yáng)性表達(dá)比例較高。進(jìn)一步提示HHLA2、TMIGD2的高表達(dá)可能與結(jié)直腸癌腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲等惡性生物學(xué)行為有關(guān)。王澤群[16]研究結(jié)果表明，HHLA2可調(diào)節(jié)CD4和CD8 T細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能，與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果中，HHLA2、TMIGD2陽(yáng)性表達(dá)患者3年生存率低于HHLA2、TMIGD2陰性表達(dá)患者，且HHLA2、TMIGD2均是影響結(jié)直腸癌患者死亡的因素。提示HHLA2、TMIGD2高表達(dá)可能與結(jié)直腸癌的低生存率有關(guān)，推測(cè)HHLA2與其受體TMIGD2表達(dá)水平升高后，抑制CD4和CD8 T細(xì)胞增殖的作用增強(qiáng)，進(jìn)而影響T細(xì)胞分泌某些細(xì)胞因子，造成患者免疫功能進(jìn)一步下降，不良預(yù)后發(fā)生率升高。臨床工作中可通過(guò)對(duì)HHLA2、TMIGD2表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步有效評(píng)估患者臨床分期等情況，預(yù)測(cè)患者不良預(yù)后，為臨床治療方案的確定提供參考。

綜上所述，HHLA2、TMIGD2在結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中高表達(dá)，且其高表達(dá)與腫瘤直徑、腫瘤浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Duke分期、腫瘤分化程度等臨床病理特征及預(yù)后不良有密切聯(lián)系。HHLA2、TMIGD2可能作為結(jié)直腸癌治療的新靶點(diǎn)，對(duì)于改善預(yù)后可能具有重要的參考價(jià)值。但作為回顧性研究，本研究中納入樣本量有限，HHLA2、TMIGD2參與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制仍需細(xì)胞或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，其臨床應(yīng)用價(jià)值仍需豐富樣本量后進(jìn)一步深入探索。