李順樂，張 迪，常 帥，李 華，趙 耀，吳 濤，陳 熹

西安交通大學第二附屬醫(yī)院普外科，陜西 西安 710004

結腸癌是臨床常見惡性腫瘤之一，近年來，我國結腸癌發(fā)病率與死亡率逐年增加，但結腸癌的發(fā)生機制尚未闡明[1]。研究表明，環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一種非編碼RNA，由于其具有閉合環(huán)狀分子導致其具有高度穩(wěn)定性，研究表明，circRNA可通過充當微小RNA(microRNA，miRNA)的海綿分子而抑制其表達從而調控腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移等生物學過程[2-3]。但circRNA在結腸癌中的研究相對較少。環(huán)狀RNA PUM1(circular RNA PUM1，circPUM1)在肺癌、卵巢癌等腫瘤中呈高表達，并可促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展[4-5]。StarBase預測顯示，circPUM1與miR-524-5p存在結合位點，研究表明miR-524-5p在胃癌細胞中呈低表達并可影響細胞對順鉑的敏感性[6]。相關報道指出，miR-524-5p可抑制胃癌細胞增殖并促進細胞凋亡[7]。但circPUM1是否通過靶向調控miR-524-5p的表達影響結腸癌細胞的惡性生物學行為尚未可知。因此，本研究主要探討circPUM1和miR-524-5p在結腸癌中的表達并分析其對細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響，以期為揭示結腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑人結腸癌細胞株SW620購自美國ATCC公司；杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；circPUM1小干擾RNA(si-circPUM1)、亂序無意義陰性序列(si-NC)購自上海漢恒生物科技有限公司；circPUM1過表達質粒(pcDNA-circPUM1)和對照質粒(pcDNA)購自廣州吉賽生物科技股份有限公司；miR-524-5p寡核苷酸模擬物(miR-524-5p mimics)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)、miR-524-5p特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-524-5p)及陰性對照(anti-miR-NC)購自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol、反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)購自北京富龍康泰生物技術有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒、RIPA裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量檢測試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；Transwell小室購自北京優(yōu)尼康生物科技有限公司；Matrigel基質膠購自美國BD公司；兔抗人細胞周期蛋白1(Cyclin D1)、p21、基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)、基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)抗體購自美國CST公司；兔抗人B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、B淋巴細胞瘤-2相關蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗購自美國Abcam公司。

結腸癌組織及癌旁組織標本來源：收集2017年10月至2018年12月本院收治的25例結腸癌患者為研究對象，所有患者均經(jīng)病理證實為結腸癌，男18例，女7例，年齡(63.57±6.59)歲(50～72歲)。排除標準：合并其他惡性腫瘤患者；術前接受放療或化療患者。術中切除結腸癌組織及癌旁組織(≥5 cm)，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染及分組：結腸癌細胞SW620置于含質量濃度為100 g/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2，待細胞生長至80%融合度時進行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)期SW620細胞，質量濃度為2.5 g/L胰蛋白酶消化，制備細胞懸液，調整細胞密度為1×104個/ml，接種于6孔板(100 μl/孔)，待細胞生長至80%融合度時將培養(yǎng)基更換為不含血清的培養(yǎng)基，參照Lipofectamine2000轉染試劑說明書分別將si-NC、si-circPUM1、miR-NC、miR-524-5p mimics、si-circPUM1與anti-miR-NC、si-circPUM1與anti-miR-524-5p轉染至SW620細胞，分別記作si-NC組、si-circPUM1組、miR-NC組、miR-524-5p組、si-circPUM1+anti-miR-NC組、si-circPUM1+anti-miR-524-5p組。轉染6 h后將培養(yǎng)基更換為含質量濃度為100 g/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測circPUM1、miR-524-5p的表達水平：采用Trizol法提取結腸癌組織、癌旁組織及各組SW620細胞中的總RNA，應用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度。按照反轉錄試劑盒說明書操作將總RNA反轉錄為cDNA。circPUM1正向引物：5′-ATGGGAGCAGCTCTTTGACT-3′，反向引物：5′-GACTCTCTCCTTGTGGCACT-3′；miR-524-5p正向引物：5′-CCAAAGGAAAAGAAGGCGCT-3′，反向引物：5′-AGCATCGATCCAGCCTAGTC-3′；6正向引物：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′， 反向引物：5′-GGAA-CGCTTCACGAATTTG-3′；GAPDH正向引物：5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，反向引物：5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。按照熒光定量PCR試劑盒說明書進行qRT-PCR檢測，反應條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40次循環(huán)。circPUM1以GAPDH為內參，miR-524-5p以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算circPUM1、miR-524-5p相對表達量。

1.2.3 MTT檢測細胞增殖：收集各組對數(shù)期SW620細胞接種于96孔板(3×104個/孔)，每組設置3個復孔，轉染24、48、72 h時向每孔加入20 μl MTT溶液，37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，經(jīng)1 300 r/min轉速離心5 min，棄上清，向每孔加入150 μl二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)，室溫避光孵育5 min，應用酶標儀檢測各孔吸光度值(OD490 nm)。實驗重復3次。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率：收集各組對數(shù)期SW620細胞，加入預冷PBS，4 ℃條件下經(jīng)1 000 r/min離心6 min(離心半徑10 cm)，棄上清，加入預冷PBS，再次離心，棄上清，加入500 μl結合緩沖液懸浮細胞，依次加入5 μl 膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)與5 μl碘化丙啶(PI)，室溫振蕩孵育10 min，于1 h內置于FACS Calibur流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.2.5 Transwell實驗檢測細胞遷移、侵襲：細胞遷移實驗：收集各組對數(shù)期SW620細胞加入Transwell小室的上室(3×104個/孔)，含質量濃度為100 g/L胎牛血清的培養(yǎng)液加入Transwell小室的下室(600 μl/孔)，37 ℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h，PBS洗滌，采用多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌，0.1%結晶紫染液染色10 min，顯微鏡下觀察遷移細胞數(shù)。細胞侵襲實驗：預冷培養(yǎng)液按照1∶8比例稀釋Matrigel基質膠，加入Transwell小室的上室(40 μl/孔)，37 ℃培養(yǎng)箱孵育5 h，取各組對數(shù)期SW620細胞加入Transwell小室的上室(3×104個/孔)，后續(xù)實驗步驟同細胞遷移實驗，顯微鏡下觀察侵襲細胞數(shù)。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測circPUM1的靶基因：StarBase預測顯示，circPUM1與miR-524-5p存在結合位點，將含有結合位點的片段克隆至pmirGLO載體得到野生型載體WT-circPUM1，采用基因定點突變技術突變結合位點構建突變型載體MUT-circPUM1，分別將WT-circPUM1、MUT-circPUM1與miR-NC、miR-524-5p mimics共轉染至SW620細胞，轉染48 h，收集細胞，采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測各組細胞熒光素酶活性。分別將pcDNA、pcDNA-circPUM1、si-NC、si-circPUM1轉染至SW620細胞，qRT-PCR檢測各組細胞中miR-524-5p的表達水平。

1.2.7 蛋白免疫印跡(Western blotting)檢測Cyclin D1、p21、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax蛋白表達：收集各組對數(shù)期SW620細胞，加入適量RIPA裂解液提取細胞總蛋白，根據(jù)BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，將分離的蛋白凝膠轉移至PVDF膜，質量濃度為50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗稀釋液(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，孵育二抗稀釋液(1∶2 000)，室溫孵育1 h，暗室內曝光顯影，應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

2 結果

2.1 circPUM1和miR-524-5p在結腸癌組織中的表達與癌旁組織相比，結腸癌組織circPUM1的表達顯著升高(P<0.05)，miR-524-5p的表達顯著降低(P<0.05)(見表1)。

表1 circPUM1和miR-524-5p在結腸癌組織中的表達Tab 1 Expressions of circPUM1 and miR-524-5p in colon

2.2 干擾circPUM1表達對結腸癌SW620細胞增殖的影響與si-NC組相比，si-circPUM1組細胞活力顯著降低(P<0.05)，Cyclin D1蛋白表達顯著降低(P<0.05)，p21蛋白表達顯著升高(P<0.05)(見圖1、表2)。

圖1 增殖相關蛋白表達Fig 1 The expression of proliferation-related protein

表2 干擾circPUM1表達對結腸癌SW620細胞增殖的影響Tab 2 The effect of interference with circPUM1 expression on the proliferation of colon cancer SW620 cells n=9)

2.3 干擾circPUM1表達對結腸癌SW620細胞遷移、侵襲的影響與si-NC組相比，si-circPUM1組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，MMP-2、MMP-9蛋白表達顯著降低(P<0.05)(見圖2、表3)。

圖2 干擾circPUM1表達對結腸癌SW620細胞遷移、侵襲的影響 A：結腸癌SW620細胞的遷移、侵襲(200×)；B：遷移侵襲相關蛋白表達Fig 2 The effect of interference with circPUM1 expression on migration and invasion of colon cancer SW620 cells A: migration and invasion of colon cancer SW620 cells(200×); B: expression of migration and invasion-related proteins

表3 干擾circPUM1表達對結腸癌SW620細胞遷移、侵襲的影響Tab 3 The effect of interference with circPUM1 expression on the migration and invasion of colon cancer SW620 cells n=9)

2.4 干擾circPUM1表達對結腸癌SW620細胞凋亡的影響與si-NC組相比，si-circPUM1組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)，Bax蛋白表達顯著升高(P<0.05)(見圖3、表4)。

圖3 干擾circPUM1表達對結腸癌SW620細胞凋亡的影響 A：細胞凋亡流式圖；B：凋亡相關蛋白表達Fig 3 The effect of interference with circPUM1 expression on the apoptosis of colon cancer SW620 cells A: apoptosis flow cytometry; B: expression of apoptosis-related protein

表4 干擾circPUM1表達對結腸癌SW620細胞凋亡的影響Tab 4 The effect of interference with circPUM1 expression on the apoptosis of colon cancer SW620 cells n=9)

2.5 miR-524-5p過表達對結腸癌SW620細胞惡性生物學行為的影響與miR-NC組相比，miR-524-5p組48 h、72 h細胞活力顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)顯著減少(P<0.05)(見圖4、表5)。Western blotting檢測結果顯示，與miR-NC組相比，miR-524-5p組細胞中Cyclin D1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)，p21、Bax蛋白表達顯著升高(P<0.05)(見圖5、表6)。

圖4 miR-524-5p過表達對結腸癌SW620細胞遷移、侵襲和凋亡的影響 A：結腸癌SW620細胞的遷移、侵襲(200×)；B：細胞凋亡流式圖Fig 4 The effect of miR-524-5p overexpression on the migration, invasion and apoptosis of colon cancer SW620 cells A: migration and invasion of colon cancer SW620 cells (200×); B: flow cytometric diagram of cell apoptosis

表5 miR-524-5p過表達對結腸癌SW620細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響Tab 5 Effects of miR-524-5p overexpression on the proliferation, migration, invasion and apoptosis of colon cancer SW620 cells

圖5 蛋白電泳圖Fig 5 Protein electrophoresis diagram

表6 miR-524-5p過表達對結腸癌SW620細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡相關蛋白表達的影響Tab 6 The effect of miR-524-5p overexpression on the proliferation, migration, invasion and apoptosis-related protein expression of colon cancer SW620 cells

2.6 circPUM1靶向調控miR-524-5p的表達StarBase預測顯示，circPUM1的序列中含有與miR-524-5p互補的核苷酸序列(見圖6)。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，轉染野生型載體WT-circPUM1的細胞中，miR-524-5p組熒光素酶活性顯著低于miR-NC組(P<0.05)；轉染突變型載體MUT-circPUM1的細胞中，miR-524-5p組熒光素酶活性與miR-NC組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表7)。qRT-PCR檢測結果顯示，與pcDNA組相比，pcDNA-circPUM1組細胞中miR-524-5p的表達水平顯著降低(P<0.05)；與si-NC組相比，si-circPUM1組細胞中miR-524-5p的表達水平顯著升高(P<0.05)(見表8)。

圖6 circPUM1的序列中含有與miR-524-5p互補的核苷酸序列Fig 6 The sequence of circPUM1 contained a nucleotide sequence complementary to miR-524-5p

表7 雙熒光素酶報告實驗Tab 7 Dual-luciferase reporter assay n=9)

表8 circPUM1調控miR-524-5p的表達Tab 8 circPUM1 regulated the expression of miR-524-5p

2.7 抑制miR-524-5p表達逆轉了干擾circPUM1表達對結腸癌SW620細胞惡性生物學行為的作用與si-circPUM1+anti-miR-NC組相比，si-circPUM1+anti-miR-524-5p組細胞活力顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)顯著增加(P<0.05)，Cyclin D1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)，p21、Bax蛋白水平顯著降低(P<0.05)(見圖7～8、表9～10)。

圖7 抑制miR-524-5p表達逆轉了干擾circPUM1表達對結腸癌SW620細胞遷移、侵襲和凋亡的作用 A：結腸癌SW620細胞的遷移侵襲(200×)；B：細胞凋亡流式圖

of cell apoptosis

圖8 蛋白電泳圖Fig 8 Protein electrophoresis diagram

表10 抑制miR-524-5p表達逆轉了干擾circPUM1表達對結腸癌SW620細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡相關蛋白表達的作用Tab 10 Inhibition of miR-524-5p expression reversed the effect of interfering with circPUM1 expression on the proliferation, migration, invasion and apoptosis-related protein expression of colon cancer SW620 cells n=9)

3 討論

circRNA在多種腫瘤中表達量異常且與腫瘤細胞惡性生物學行為有關，其基因序列中含有miRNA的反應元件，并可通過堿基互補配對原則吸附相關miRNA從而調控下游基因表達進而參與結腸癌等多種腫瘤發(fā)生過程[8-9]。既往研究顯示，circRNA在結腸癌組織或細胞中異常表達并可能發(fā)揮抑癌作用或促癌作用[10-11]。但仍有部分circRNA在結腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的調控機制尚未闡明。因此，本研究積極探尋新型circRNA并分析其對結腸癌細胞惡性生物學行為的影響，為結腸癌的靶向治療提供潛在靶點。

circPUM1在肺腺癌中表達水平升高，并可通過競爭性結合miR-326從而促進肺腺癌發(fā)生、發(fā)展[12]。但circPUM1對結腸癌細胞生物學行為的影響尚未可知。本研究結果顯示，circPUM1在結腸癌組織中呈高表達，與上述研究結果相似。提示circPUM1在結腸癌發(fā)生過程中可能發(fā)揮癌基因作用。本研究通過體外細胞實驗證明，干擾circPUM1表達可明顯抑制結腸癌細胞增殖，提示circPUM1表達量升高可促進結腸癌細胞增殖。研究表明，Cyclin D1在腫瘤細胞中高表達并可促進細胞周期由G1期進入S期，促進細胞增殖，而p21可抑制細胞周期進程從而誘導細胞周期停滯于G1期，抑制細胞增殖[13]。本研究結果顯示，干擾circPUM1表達可明顯抑制Cyclin D1表達，促進p21表達，提示干擾circPUM1表達可能通過調控細胞周期相關蛋白表達從而抑制結腸癌細胞增殖。基質金屬蛋白酶在腫瘤細胞遷移、侵襲過程中發(fā)揮重要作用，研究表明MMP-2、MMP-9屬于基質金屬蛋白酶類，其在腫瘤中表達量升高并可降解胞外基質沉積從而促進細胞遷移及侵襲[14]。本研究結果顯示，干擾circPUM1表達后結腸癌細胞的遷移、侵襲能力明顯降低，并可抑制MMP-2、MMP-9表達，提示干擾circPUM1表達可能通過下調MMP-2、MMP-9表達從而抑制結腸癌細胞遷移、侵襲。細胞凋亡在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，研究表明，Bcl-2屬于抗細胞凋亡蛋白，Bax屬于促細胞凋亡蛋白，Bax表達量升高可促進細胞色素C轉移至線粒體從而激活caspase級聯(lián)反應最終誘導細胞凋亡[15]。本研究結果顯示，干擾circPUM1表達后，結腸癌細胞凋亡率顯著增加，Bax表達量升高，Bcl-2表達量降低，提示干擾circPUM1表達可能通過調控線粒體途徑從而促進結腸癌細胞凋亡。

miR-524-5p可抑制胃癌細胞增殖及侵襲[16]。研究表明，lncRNA TUG1可通過競爭性結合miR-524-5p從而促進口腔鱗狀細胞癌的發(fā)生及發(fā)展[17]。相關報道指出，miR-524-5p在甲狀腺乳頭狀癌細胞中表達下調，上調miR-524-5p表達可抑制腫瘤發(fā)展進程[18]。與上述研究結果相似，本研究結果顯示，miR-524-5p在結腸癌組織中表達量降低，進一步研究顯示，miR-524-5p過表達可明顯抑制結腸癌細胞增殖、遷移、侵襲，并可促進細胞凋亡，提示miR-524-5p在結腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮抑癌基因作用。為驗證miR-524-5p調控結腸癌細胞生物學行為的機制，通過Western blotting實驗分析顯示，Cyclin D1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2的表達量明顯降低，p21、Bax的表達量明顯升高，提示miR-524-5p過表達可通過調控細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲相關蛋白表達從而發(fā)揮作用。本研究結果顯示，circPUM1可結合miR-524-5p從而調控其表達，進一步分析顯示，抑制miR-524-5p表達可明顯減弱干擾circPUM1表達對結腸癌細胞惡性生物學行為的作用，提示干擾circPUM1表達可通過上調miR-524-5p表達從而抑制結腸癌細胞增殖、遷移、侵襲，并可誘導細胞凋亡。

綜上所述，circPUM1在結腸癌中表達量升高，miR-524-5p在結腸癌中表達量降低，干擾circPUM1表達或miR-524-5p過表達可明顯降低結腸癌細胞增殖、遷移、侵襲能力，促進細胞凋亡，本研究證實circPUM1可競爭性吸附miR-524-5p從而負向調控miR-524-5p的表達，circPUM1可作為結腸癌診斷及治療的分子靶標。