鐘景斌,劉文彬,王 暉*
1廣東藥科大學中藥學院;2廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院 廣東省生物活性藥物研究重點實驗室,廣州 510006
ALD是指長期飲酒誘發(fā)肝臟出現(xiàn)損傷性的疾病,其以酒精性脂肪肝為表現(xiàn),可轉化為酒精性肝炎、肝纖維化,進一步可惡化為肝硬化,甚至演變?yōu)橥砥诘母渭毎┑认盗屑膊1]。逐年增加的酒精消費量與我國慢性肝病中ALD的發(fā)病率呈正比關系,而大多數(shù)患者對ALD認識不夠,忽略ALD的危害性,其并發(fā)癥和死亡率較高,亟需成為公眾關注的健康問題之一?,F(xiàn)有研究表明,酒精介導的肝損傷、肝臟脂肪變性、氧化應激、腸道菌群介導免疫炎癥、細胞自噬等方面參與ALD發(fā)病機制[2],但其發(fā)病機制復雜,尚未完全闡述清楚。目前暫無確切治療ALD的方法及藥物,因此,尋找、開發(fā)治療ALD藥物成為研究的焦點,而中藥在降低ALD的肝功能異常指標與改善患者臨床癥狀中具有廣闊治療前景。
溪黃草為唇形科香茶菜屬植物線紋香茶菜Isodonlophanthoides(Buch.-Ham.ex D.Don)H.Hara干燥地上部分,其變種狹基線紋香茶菜、纖花線紋香茶菜或同屬植物溪黃草亦作為溪黃草的來源。溪黃草有清熱利濕、退黃、涼血散瘀功效,治療濕熱黃疸、瀉痢、急性黃疸型肝炎、急性膽囊炎等疾病。其成分復雜,二萜類、三萜類、黃酮類等成分是其發(fā)揮抗腫瘤、保肝、利膽、抗氧化、抗菌抗炎、清除自由基等藥理作用的物質基礎[3]。目前,溪黃草的研究主要集中在其水提物對肝損傷、肝纖維化、肝癌等作用研究[4,5],而對其藥效成分、分子靶點等相關方面有待深入研究。近年來,黃酮類成分在防治酒精性肝損傷中取得一定進展,溪黃草黃酮能通過增強抗氧化應激能力對酒精導致急性肝損傷有預防保護作用,顯著減輕肝臟病理損傷,降低脂質過氧化指標[6],但缺乏溪黃草黃酮對ALD的分子靶點、通路調控機制的深入研究,為此,本文借助網絡藥理學與分子對接技術探討溪黃草黃酮類成分治療ALD的作用機理,為其臨床應用提供理論依據(jù)。
通過CNKI數(shù)據(jù)庫、PubMed數(shù)據(jù)庫以溪黃草或線紋香茶菜為關鍵詞進行檢索,通過文獻查對、收集來源于線紋香茶菜植物的溪黃草黃酮類成分,再利用PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取每個化合物的分子式、CAS號、下載2D結構的SDF文件;進而通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索成分名稱、查對化學結構式,獲取溪黃草黃酮類成分的口服利用度(oral bioavailability,OB)、類藥性(drug-like,DL)信息,建立溪黃草黃酮類化合物信息數(shù)據(jù)庫。
將“1.1”項下得到的每個成分的SDF格式文件導入到PharmMapper數(shù)據(jù)庫(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/)獲得溪黃草黃酮類成分潛在的靶點。將獲得的靶點對應的PDB ID號通過UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/uploadlists/)中的Retrieve/ID mapping的轉化功能,限定物種為人,排除非人源的靶點,經上述數(shù)據(jù)庫轉化操作,獲得校正后的基因名稱。
在Genecard數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中以“alcoholic liver disease”為關鍵詞進行檢索,獲取ALD疾病的相關靶點。在該數(shù)據(jù)庫中,Score值越高表示該靶點與疾病相關程度越高。然后,通過Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)將“1.2”項下獲得的溪黃草黃酮類成分預測靶點經去重后與ALD疾病靶點取交集靶點。
將“1.3”項的交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫中“multiple proteins”選項中,在“organism”處選擇物種來源為人,交互作用大于0.4的靶點,并隱藏游離的節(jié)點,運行后即可得到溪黃草黃酮類成分對ALD作用的PPI網絡。度值越大代表靶點在PPI網絡中越處于核心作用,下載STRING數(shù)據(jù)庫的生成有關PPI網絡信息的“TSV”文件,將其導入Cytoscape3.7.0軟件,通過Network Analyzer功能進行分析網絡中節(jié)點的度值,篩選核心靶點。
通過DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)將交集靶點導入基因列表中,選擇“OFFICIAL-GENE-SYMBOL”,選定物種為“Homo sapiens”,獲取數(shù)據(jù)對GO功能和KEGG通路進行分析,設置P<0.05,根據(jù)靶點富集程度進行降序,篩選排名靠前的生物過程和通路,并對數(shù)據(jù)進行可視化。
將“1.1”項的溪黃草黃酮類成分、“1.3”項的交集靶點、“1.5”項的通路導入Cytoscape3.7.0軟件構建溪黃草黃酮類成分對ALD的作用成分-靶點-通路網絡圖。利用Network Analyzer功能進行拓撲分析,根據(jù)度值大小篩選排名前5位成分進行分子對接驗證[7]。
在TCMSP數(shù)據(jù)庫中下載“1.6”項的度值前5位的黃酮類成分的mol.2文件,建立活性成分配體庫。利用AutoDockTools(1.5.6)對每個成分進行加氫、計算電荷、加Root后保存“pdbqt”格式文件。在PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)中下載“1.4”項的核心靶點的度值排名靠前的靶點信息,下載格式為pdb格式,作為核心靶點受體庫。利用PyMol(2.3.4)將靶點蛋白去除配體、水分子后導入AutoDockTools(1.5.6)進行加氫、計算電荷,并保存為“pdbqt”格式文件。由蛋白的配體所處的結構位置為活性口袋,并利用AutoDock Tools確定對接盒子的大小和中心進行分子對接處理,并通過PyMol(2.3.4)進行受體配體的相互作用模式分析。當結合能<0可以判斷受體配體二者之間自發(fā)結合,結合能越低,活性成分越容易與受體結合。
通過檢索文獻[8,9]獲得12種來源于線紋香茶菜中的溪黃草黃酮類成分,通過PubChem數(shù)據(jù)庫查找,匹對成分的結構信息,在TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲取每個成分的OB、DL值,如表1所示。帶“*”號的成分由于OB值較低,但部分成分其生物活性較強,藥理作用明確,所以納入構建溪黃草黃酮類成分的數(shù)據(jù)庫。如蘆丁具有多種藥理活性,研究證實,其通過減低TGF-β1、IL-1β、結締組織生長因子和膠原蛋白的表達具有抗肝纖維化,且表明其通過抑制NF-κB活化、促炎細胞因子及Nrf2的釋放、減弱由膽管結扎(BDL)誘導肝損傷的氧化應激[10]。
表1 溪黃草中12個黃酮類成分信息
通過PharmMapper、Uniprot數(shù)據(jù)庫獲取成分靶點信息,經刪除無效與重復靶點,共獲取溪黃草黃酮類成分作用靶點382個。
通過Genecard數(shù)據(jù)庫的檢索,根據(jù)相關評分(relevance score)設置篩選條件為≥5,篩選出4 267個與酒精性肝病相關的靶點。通過韋恩圖Venny2.1.0繪制獲得172個交集靶點,為溪黃草黃酮類成分治療酒精性肝病潛在的靶點(見圖1)。
圖1 溪黃草黃酮類成分靶點與酒精性肝病靶點的交集靶點
將172個交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫,得到成分與疾病靶點的PPI網絡,PPI網絡中顯示節(jié)點168個,邊942條,平均節(jié)點度值為11.2。以節(jié)點度值為評價參數(shù),設置度值≥23為篩選條件,篩選出24個核心靶點,節(jié)點度值(degree)越大說明其在PPI網絡中越重要,可能在發(fā)揮生物學功能中起著重要的作用。使用Cytoscape3.7.0對STRING數(shù)據(jù)庫獲得的數(shù)據(jù)進行分析,節(jié)點越大,相應的度值越大,顏色越紅。并通過Cytoscape3.7.0中的Cytohubba插件篩選出核心靶點。如圖3所示。選取度值排名靠前的核心靶點:HSP90AA1(degree:50)、VEGFA(degree:49)、CCND1(degree:48)作為分子對接驗證的靶點。
圖2 蛋白質相互作用網絡
圖3 24個核心靶點的相互作用網絡
由GO富集結果得知,在P<0.05條件下,得到生物學功能條目共有92條,其中涉及生物過程(biological process,BP)為52條,溪黃草黃酮類成分主要參與包括RNA、DNA轉錄的正負調控、細胞凋亡正負調節(jié),血管內皮生長因子受體信號,Notch信號通路、NF-κB調節(jié),Wnt信號通路的調節(jié)、STAT3蛋白的絲氨酸磷酸化、DNA損傷的內在凋亡、細胞周期調節(jié)、脂質穩(wěn)態(tài)等生物學過程,表明溪黃草黃酮類成分作用于ALD主要參與涉及細胞周期調控、氧化應激、脂質代謝、炎癥途徑等反應。細胞成分(cellular component,CC)富集了24條,主要參與胞外體、細胞表面、焦點粘附、轉錄因子復合體、Toll樣受體1-Toll樣受體2蛋白復合物等。分子功能(molecular function,MF)共富集16條目,涉及三磷酸腺苷結合、鋅離子結合、染色質結合、轉錄調節(jié)區(qū)DNA結合、金屬內肽酶活性、類固醇結合、受損的DNA結合、氧化還原酶活性等重要生物功能(見圖4,BP、CC、MF根據(jù)富集基因數(shù)量只展示前10的條目)。由KEGG富集分析得到27條通路(P<0.05),溪黃草黃酮類成分主要參與多條癌癥通路、PI3K/Akt信號通路、癌癥中的蛋白多糖、病毒致癌作用、乙型肝炎、FoxO信號通路、p53信號通路、細胞周期、PPAR信號通路、丙氨酸/天冬氨酸和谷氨酸代謝等重要通路發(fā)揮作用。如圖5所示對前20條重要通路進行可視化處理。
圖4 關鍵靶點的GO富集分析
將12種溪黃草黃酮類成分,172個交集靶點,27條重要通路使用Cytoscape3.7.0構建溪黃草黃酮類成分-靶點-通路網絡(見圖6)。該網絡圖包含211個節(jié)點,634條邊,其中12個黃色菱形節(jié)點代表了溪黃草黃酮類成分,172個紅色倒三角形代表了交集靶點,27個深藍色三角形代表重要的通路,邊表示成分、靶點、通路三者之間聯(lián)絡關系。根據(jù)度值的大小,篩選出前5個成分作分子對接驗證,分別為vitexin(degree:43)、quercetin(degree:41)、isoschaftoside(degree:40)、vicenin 2(degree:38)、azaleatin(degree:36)。
圖6 溪黃草黃酮類成分-靶點-通路網絡
配體與受體在結合時,構象越穩(wěn)定其能量越低,相互作用的可能性越大。以結合能≤-5 kJ/mol為判斷相互作用能力的依據(jù)。如表2顯示,5個溪黃草黃酮類成分的結合能均<0,說明其能與靶點產生自發(fā)性結合。其中,在HSP90AA1靶點中,5個成分全部與靶點產生較好的結合特性,而在VEGFA靶點中,只有quercetin與其產生相互作用能力。在CCND1靶點中,quercetin與azaleatin兩種成分的結合能為-5 kJ/mol,與其產生較好結合效應。從總體上進行推測,分子對接顯示溪黃草黃酮類成分與核心靶點有較好的結合活性。利用PyMol(2.3.4)將5個配體成分中結合能最低的成分與3個靶點繪制成分與靶點對接模式圖。Isoschaftoside-HSP90AA1的結合位點為Asp-93、Leu-107、Tyr-139氨基酸殘基,quercetin-VEGFA通過Glu-23、Gly-52、Leu-25氨基酸殘基發(fā)揮作用效應,quercetin-CCND1的結合位點為Glu-115、Lys-72、Gln-71、Lys-123、Thr-120氨基酸殘基(見圖7)。
表2 部分成分與靶點分子對接結果
圖7 成分-靶點對接相互作用模式
通過對溪黃草黃酮類成分分析,從構建的網絡圖中篩選度值排名前5的成分。其中,牡荊苷為黃酮碳苷類成分,可調控凋亡信號,最近研究顯示[11],牡荊苷對酒精誘導肝損傷有保護作用,可能與調節(jié)Sirt1/p53介導線粒體凋亡途徑減少肝細胞凋亡、降低氧化應激和炎癥水平有關。槲皮素能降低長期攝入酒精導致血清中ALT、AST、TG含量升高,通過降低脂蛋白2(PLIN2)水平,激活AMPK信號促進脂肪吞噬,表明其對酒精導致的肝脂肪變性有保護作用[12]。由于肝星狀細胞的活化是引起肝纖維化的原因,其通過調節(jié)TGF-β1/Smads和PI3K/Akt通路之間的相互作用來減弱肝星狀細胞的活化,并減少自噬而緩解肝纖維化加重的趨勢[13]。異夏佛塔苷能顯著抑制非小細胞肺癌A549細胞存活率,其抗腫瘤機制與調控細胞凋亡有關[14]。新西蘭牡荊苷2能降低肝損傷標志物ALT、AST水平和炎癥因子的表達,抑制MAPK激活、調控TLR信號通路減輕由LPS誘導肝損傷引起的炎癥反應,表明其具有保肝作用[15]。因此,可推測上述的溪黃草黃酮中核心成分通過調控細胞凋亡、降低氧化應激、抗肝纖維化、降低炎癥水平等方面發(fā)揮干預ALD的潛在作用。
由核心靶點網絡圖可知,溪黃草黃酮類成分作用于ALD的靶點有24個核心靶點,并對HSP90AA1、VEGFA、CCND1、IL10、FOXO3等度值較大的靶點進行文獻分析。熱休克蛋白90AA1(HSP90AA1)轉導能促進癌癥相關成纖維細胞慢性炎癥的信號,通過激活NF-κB和STAT3轉錄,分泌炎癥細胞因子誘導炎癥反應。而炎癥反應能加速ALD的發(fā)展,在酒精性肝硬化中HSP90AA1誘導與NLRP3炎性小體呈正相關,抑制HSP90AA1進而降低NLRP3炎性體活性使炎癥細胞因子分泌減少,減輕炎癥反應[16]。血管內皮生長因子A(VEGFA)能誘導內皮細胞增殖、誘導新血管生成,其與肝細胞癌,尤其是酒精性肝硬化的生理病理有關。酒精攝入會增加肝臟氧氣的消耗,易誘導缺氧誘導因子(HIFs)的活化,促進VEGFA轉錄,引起ALD中肝纖維化的發(fā)生[17]。細胞周期蛋白D1(CCND1)主要功能為促進細胞增殖,但其過度表達可致細胞增殖失控,促進惡性腫瘤細胞的侵襲和轉移。過表達的CCND1與肝細胞癌相關,而在體外研究表明槲皮素下調CCND1表達以干擾HepG2細胞的細胞周期和增殖[18]。另外,IL-10是在免疫調節(jié)和炎癥中發(fā)揮多效作用的細胞因子,可抑制ALD中炎癥細胞因子LPS、TNF-α、IL-6的產生,通過減少肝臟炎癥和脂肪變性發(fā)生而保護肝臟[19]。叉形頭轉錄因子O亞型3(FOXO3)廣泛參與細胞自噬、凋亡、氧化應激反應等生物學過程,其能誘導凋亡基因的表達,在肝細胞癌中表現(xiàn)出抗腫瘤特性[20]。綜上,預測的核心靶點參與了ALD的發(fā)病機制,推測溪黃草黃酮類成分可通過作用這些核心靶點發(fā)揮潛在的治療機制。
從KEGG富集通路中可知溪黃草黃酮類成分治療ALD可能通過PI3K/Akt信號通路、FoxO信號通路、p53信號通路等關鍵通路發(fā)揮作用。其中,PI3K/Akt信號通路通過激活下游相應的效應分子參與細胞增殖、凋亡、葡萄糖代謝等生理活動發(fā)揮作用。另有研究證實,通過抑制PI3K/Akt信號傳導,降低氧化應激和炎癥因子水平,對活化的肝星狀細胞有抑制作用,進而阻止肝纖維化的發(fā)展[21]。在ALD發(fā)病機制中,氧化應激與細胞凋亡被認為是其重要的機制之一,而細胞處于氧化應激狀態(tài)時,可激活PI3K/Akt信號通路及相關響應因子。推測PI3K/Akt通路為ALD發(fā)病機制的關鍵信號通路。FOXO蛋白是生長因子和應激調節(jié)的轉錄因子,作為氧化應激介體參與氧化應激過程,在細胞DNA損傷和修復、調控代謝等過程具有重要的作用。p53為腫瘤抑制因子,其調控細胞增殖、衰老、細胞凋亡等代謝活動,介導癌癥、糖尿病、肝病等疾病的代謝過程。類黃酮物質黃腐酚通過調控NF-κB/p53信號通路抑制人肝癌HepG2的生長、凋亡[22]。上述三條通路在治療ALD中主要參與了氧化應激過程、炎癥反應、細胞自噬、抗細胞纖維化等過程,可進一步推測溪黃草黃酮類成分調節(jié)這些關鍵通路發(fā)揮治療ALD作用機理。另外,結合分子對接的技術,初步模擬成分與靶點之間相互作用關系,結合能的大小直接反映預測結果的可靠性。
本研究通過網絡藥理學和分子對接相結合的方法,確定溪黃草中黃酮類成分具體藥效物質,從多個方面探討了黃酮類成分治療ALD的分子靶點、調控通路的作用機制,體現(xiàn)了溪黃草黃酮類成分具有多靶點多途徑的作用特點,且其預測的結果與文獻報道相符,為后續(xù)深入研究溪黃草黃酮防治ALD的作用機制提供理論依據(jù)。