王愷純，徐勤芬，劉 微，胡道德*

1上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科；2南京醫(yī)科大學(xué)附屬上海一院臨床醫(yī)學(xué)院臨床藥學(xué)科，上海200080

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)作為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居全球第三，死亡率位居全球第二[1]。雖然診斷與治療的進步延長了部分患者的生命，但是，患者5年生存率仍只有64%[2]，這一數(shù)據(jù)與10年前相比無明顯變化。目前，結(jié)直腸癌的主要治療手段為手術(shù)結(jié)合放化療，其嚴重的副作用使患者生活質(zhì)量明顯下降。近年來，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，天然藥物在抑制結(jié)直腸癌增殖、減輕放化療毒副作用方面具有一定優(yōu)勢，是結(jié)直腸癌治療的重要手段之一[3,4]。

通關(guān)藤藥材(Marsdeniatenacissima(Roxb.) Wight et Arn)是蘿藦科植物通關(guān)藤的藤莖，主要產(chǎn)自云南、貴州等省份。研究發(fā)現(xiàn)，通關(guān)藤藥理作用較為廣泛，具有抗癌、平喘、免疫調(diào)節(jié)、降壓、止痛、利尿以及緩解放化療導(dǎo)致的腫瘤患者白細胞下降等作用[5]。此外，臨床上亦將其用于治療胃癌、肺癌、肝癌、白血病等多種腫瘤，療效較為顯著。有研究證明，通關(guān)藤總皂苷具有抗肝癌細胞增殖作用[6]，是其主要抗癌活性成分。通關(guān)藤苷G(tenacissoside G，TG)化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示，是通關(guān)藤總皂苷中成分之一。有研究報道，TG可能為通關(guān)藤中治療非小細胞肺癌的主要活性成分，通過PI3K/Akt等多條信號通路發(fā)揮抗肺癌作用[7]。但目前關(guān)于TG抗結(jié)直腸癌的作用和機制尚未見報道。本實驗以人結(jié)直腸癌細胞RKO和LoVo為研究對象，觀察TG對結(jié)直腸癌細胞增殖活性的影響，并對其可能的作用機制進行探究。

圖1 通關(guān)藤苷G的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與儀器

1.1 試驗藥物

通關(guān)藤苷G(純度 ≥ 98%，批號HT177497)，購自寶雞市辰光生物科技有限公司。

1.2 試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基、F12k培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素溶液、胎牛血清(Gibco公司)；CCK-8試劑(MCE公司)；細胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、上樣緩沖液(蘇州新賽美公司)；細胞周期檢測試劑盒(美國BD公司)；CDK2、CDK4、CDK6、Cyclin D1、Cyclin E1、p21、cleaved Caspase 3、cleaved PARP、ATM、p-ATM、CHK2、p-CHK2、p53、p-p53、GAPDH抗體(美國CST公司)；HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)、HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)、CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(Proteintech公司)；AL104電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(SANYO公司)；酶標儀(Bio-Tek公司)；ECLIPSETi-5型熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；BD Accuri C6流式細胞儀(美國BD公司)；Tanon-5500型化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀器(中國天能科技有限公司)；Power PacTMBasic型電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)液的配制

將10%胎牛血清(V/V)、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液分別和DMEM高糖培養(yǎng)基或F12k培養(yǎng)基混勻，在4 ℃條件下儲存，備用。

2.2 細胞培養(yǎng)

人結(jié)直腸癌細胞RKO(貨號：TCHu116)和LoVo(貨號：TCHu 82)均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。復(fù)蘇RKO和LoVo細胞，置于細胞培養(yǎng)皿中，加入細胞培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1～2天更換一次培養(yǎng)液。取對數(shù)生長期的細胞用于實驗，細胞融合度約90%時用胰蛋白酶消化傳代以用于后續(xù)實驗。

2.3 細胞增殖活性檢測

取對數(shù)生長期的RKO和LoVo細胞，用新鮮培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞濃度為8×104個/mL，按每孔100 μL接種于96孔板，每孔設(shè)置6復(fù)孔。貼壁后，設(shè)置空白組(只加培養(yǎng)液)、對照組(不加藥組)、實驗組(TG濃度為25、50、100、200和400 μM)，每孔均設(shè)6復(fù)孔，分別處理24 h和48 h，結(jié)束前吸去藥液，每孔加入10 μL CCK-8試劑和90 μL培養(yǎng)液。培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)2 h，置酶標儀上450 nm波長處檢測吸光度A。細胞活性=(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%，實驗重復(fù)3次。

2.4 平板克隆檢測不同濃度通關(guān)藤苷G對細胞生長增殖的影響

取對數(shù)生長期的RKO和LoVo，調(diào)整細胞濃度為5×103個/mL，按每孔100 μL接種于6孔板。貼壁后，棄培養(yǎng)液，加入50 μM和100 μM TG，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)14天。取出6孔板，吸棄培養(yǎng)液，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)潤洗3次，加入多聚甲醛室溫固定30 min后PBS洗3次，每孔加入1 mL結(jié)晶紫溶液，室溫染色30 min后PBS清洗3次至肉眼可見紫色細胞集落。記錄集落數(shù)，計算試驗組和對照組集落數(shù)比值。實驗重復(fù)3次。

2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞周期

取對數(shù)生長期的RKO和LoVo，調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL，按每孔1 mL接種于6孔板。貼壁后棄培養(yǎng)基，設(shè)置對照組(不加藥組)、實驗組(TG濃度為50、100和200 μM)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄去藥液，胰酶消化，離心收集細胞，75%預(yù)冷的乙醇重懸，4 ℃放置過夜。PBS清洗兩遍，加入500 μL含RNase的碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液，4 ℃避光孵育30 min，過篩，上機檢測，記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光。實驗重復(fù)3次。

2.6 彗星實驗檢測細胞DNA損傷程度

取對數(shù)生長期的RKO和LoVo，調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL，按每孔1 mL接種于6孔板。貼壁后棄培養(yǎng)基，設(shè)置對照組(不加藥組)和實驗組(藥物組)。給藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄去藥液，胰酶消化，離心收集細胞，PBS重懸。將低熔點瓊脂糖凝膠液化，加入稀釋后的細胞懸液，混合均勻后鋪在彗星載玻片透明孔上，保持水平，避光4 ℃放置15 min。將玻片置于裂解緩沖液中避光4 ℃放置30 min，吸去裂解液，PBS清洗后加入預(yù)冷的堿性電泳液避光4 ℃放置30 min，20 V，300 mA電泳30 min。將玻片轉(zhuǎn)移至干凈容器中，去離子H2O清洗3遍，預(yù)冷的70%乙醇固定5 min。室溫風(fēng)干玻片，每個樣品加入100 μL稀釋好的Vista Green DNA染料，室溫孵育15 min。實驗重復(fù)3次。

2.7 免疫熒光檢測γ-H2AX水平變化

取對數(shù)生長期的RKO和LoVo，以每孔1×104個細胞接種于24孔板中。貼壁后棄培養(yǎng)基，設(shè)置對照組(不加藥組)和實驗組(藥物組)。給藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。PBS清洗3遍，預(yù)冷的甲醇-20 ℃固定20 min。PBS清洗3遍后，加入0.1%的Triton X-100，室溫孵育15 min。PBS清洗3遍后，加入牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)室溫封閉1 h。吸棄BSA后，加入一抗，4 ℃孵育過夜。含吐溫的Tris-HCl緩沖鹽溶液(Tris buffered saline with Tween 20，TBST)清洗4遍后加入二抗，避光室溫孵育2 h。用TBST清洗4遍，再加入4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)，避光室溫孵育30 min。TBST清洗3遍，熒光倒置顯微鏡觀察并拍照。實驗重復(fù)3次。

2.8 Western blot檢測DNA損傷及凋亡相關(guān)蛋白表達水平變化

取對數(shù)生長期的RKO和LoVo，調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL，按每孔1 mL接種于6孔板。貼壁后棄培養(yǎng)基，設(shè)置對照組(不加藥組)和實驗組(藥物組)。給藥后培養(yǎng)48 h。棄培養(yǎng)液，PBS洗3遍，每孔加入200 μL含苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride， PMSF)和磷酸酶抑制劑的RIPA細胞裂解液，冰上裂解30 min，收集至1.5 mL離心管中，離心(4 ℃，15 000 g，10 min)取上清。用BCA比色測定法對細胞裂解液中蛋白含量進行定量后，加入上樣緩沖液，100 ℃金屬浴中變性10 min。用10%～15%聚丙烯酰胺SDS凝膠電泳蛋白樣品，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，10%脫脂牛奶室溫封閉1 h。一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗4次，每次10 min。二抗室溫孵育1 h，TBST洗4次，每次10 min。增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)進行顯影，ImageJ對條帶進行灰度分析。實驗重復(fù)3次。

2.9 統(tǒng)計分析處理

3 結(jié)果

3.1 TG抑制結(jié)直腸癌細胞增殖

利用CCK-8法檢測TG對結(jié)直腸癌細胞株RKO和LoVo細胞生長抑制作用，結(jié)果如圖2所示。不同濃度TG分別作用細胞24、48和72 h后，RKO和LoVo細胞活性受到明顯抑制，且抑制效果呈時間和濃度依賴性。平板克隆實驗結(jié)果同樣證明TG對細胞的增殖抑制作用，見圖3。根據(jù)抑制率結(jié)果計算得到，TG作用于RKO細胞24、48、72 h的IC50分別為334.68 μM(24 h)、91.71 μM(48 h)和57.42 μM(72 h)；作用于LoVo細胞24、48、72 h的IC50分別為257.72 μM(24 h)、88.34 μM(48 h)和63.69 μM(72 h)。

圖3 不同濃度TG對結(jié)直腸癌細胞集落形成的影響(n=3)

圖2 不同濃度TG對結(jié)直腸癌細胞增殖的影響(n=6)

3.2 TG對結(jié)直腸癌細胞周期的影響

將RKO和LoVo細胞進行藥物處理，設(shè)置TG濃度為50、100和200 μM，利用流式細胞術(shù)檢測細胞周期比例變化，結(jié)果見圖4和表1。與空白對照組相比較，給藥后RKO細胞G0/G1期細胞由39.01%增至79.89%，LoVo細胞G0/G1期細胞由40.19%增至81.71%，且呈濃度依賴性升高(P< 0.05)。S期細胞比例顯著遞減，而G2/M期細胞比例無明顯變化(P> 0.05)。上述結(jié)果提示TG可抑制細胞G1期向S期的轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)G0/G1期阻滯。

圖4 TG對結(jié)直腸癌細胞周期的影響

表1 各組人結(jié)直腸癌細胞RKO和LoVo周期比較

利用不同濃度TG處理結(jié)直腸癌細胞48 h后，Western blot實驗結(jié)果(圖5)顯示，與對照組相比，給藥后細胞內(nèi)CDK2、CDK4和CDK6、Cyclin D1和Cyclin E蛋白表達水平均顯著下降且細胞周期抑制劑p21的表達水平明顯上升(P< 0.01)。表明TG可通過調(diào)控周期相關(guān)蛋白表達水平，誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞G0/G1期阻滯作用。

圖5 TG對結(jié)直腸癌細胞內(nèi)周期相關(guān)蛋白表達水平的影響(n=3)

3.3 TG誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞DNA損傷

堿性彗星實驗(圖6)顯示，TG可顯著誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞DNA損傷。不同濃度(50、100和200 μM)TG處理48 h后，RKO和LoVo細胞的彗星拖尾顯著增加，且尾部DNA含量由低濃度組的45.76%(RKO)和43.82%(LoVo)上升至高濃度組的90.16%(RKO)和91.21%(LoVo)。與對照組0.01%(RKO)和0.00%(LoVo)的DNA含量相比顯著升高(P< 0.01)，表明給藥后細胞DNA單、雙鏈斷裂明顯增多，DNA損傷水平顯著升高。

圖6 彗星實驗結(jié)果圖及TG對細胞tailDNA含量的影響(n=3)

3.4 TG促進DNA雙鏈斷裂標記蛋白的表達

利用免疫熒光染色觀察給藥48 h后RKO和LoVo細胞內(nèi)γ-H2AX的分布情況。實驗結(jié)果如圖7，與對照組相比，給藥組細胞內(nèi)γ-H2AX陽性灶點數(shù)顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.01)，表明TG誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞RKO和LoVo發(fā)生DNA雙鏈斷裂。

圖7 免疫熒光染色檢測TG對細胞內(nèi)γ-H2AX表達水平的影響(n=3)

3.5 TG調(diào)控ATM-CHK2-p53信號通路誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞凋亡

Western blot實驗(圖8)結(jié)果顯示，與對照組相比，給藥48 h后內(nèi)凋亡標志蛋白cleaved PARP和cleaved Caspase 3表達水平顯著上升(P< 0.001)，且呈濃度依賴性。為了進一步闡明TG引起凋亡的分子機制，本研究對DNA損傷應(yīng)答中的關(guān)鍵蛋白ATM表達水平進行檢測。結(jié)果(圖8)顯示，藥物處理組細胞內(nèi)ATM磷酸化水平顯著升高(P< 0.01)。進一步檢測ATM-CHK2-p53信號通路相關(guān)蛋白的表達水平后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，p-ATM/ATM，p-CHK2/CHK2和p-p53/p53比值均顯著升高，表明TG可能通過激活A(yù)TM-CHK2-p53信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡。

圖8 TG對結(jié)直腸癌細胞內(nèi)DNA損傷及凋亡相關(guān)蛋白表達水平的影響(n=3)

4 討論

通關(guān)藤作為一種傳統(tǒng)中藥，臨床上具有抗癌的功效。相關(guān)研究報道，通關(guān)藤提取所得的消癌平制劑對腫瘤細胞增殖有顯著的抑制作用，其總皂苷提取物可誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)揮其抗癌活性作用[8]。因此，我們對通關(guān)藤的主要有效成分通關(guān)藤苷G抗結(jié)直腸癌藥理作用及分子機制進行研究。實驗結(jié)果顯示，通關(guān)藤苷G能顯著抑制結(jié)直腸癌細胞增殖，并通過誘導(dǎo)細胞DNA損傷、激活A(yù)TM-CHK2-p53通路，引起p53介導(dǎo)的周期阻滯和細胞凋亡。

維持基因組DNA的完整性對細胞的生長增殖具有至關(guān)重要的意義，然而細胞可能由于內(nèi)、外部諸多物理或化學(xué)因素導(dǎo)致不同程度的DNA損傷。其中，DNA雙鏈斷裂是最嚴重的一種DNA損傷[9]。當(dāng)DNA發(fā)生雙鏈斷裂時，細胞的DNA損傷應(yīng)答機制使該DNA周邊的H2AX組蛋白發(fā)生磷酸化，形成γ-H2AX[10]。γ-H2AX可在數(shù)分鐘內(nèi)在損傷處簇集形成γ-H2AX焦點，且焦點數(shù)量與DNA雙鏈斷裂水平呈正向?qū)?yīng)關(guān)系，因此被公認為是DNA雙鏈斷裂的敏感性分子標記物之一。我們首先利用彗星實驗對TG給藥后細胞內(nèi)DNA損傷情況進行檢測后發(fā)現(xiàn)，藥物處理組細胞尾部DNA含量顯著升高，證明TG誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞DNA損傷的發(fā)生。此外，免疫熒光染色法結(jié)果顯示，與對照組相比，藥物處理組細胞內(nèi)γ-H2AX陽性灶數(shù)量顯著升高，γ-H2AX表達水平顯著上升，進一步證明了TG通過誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂引起DNA損傷。

DNA損傷應(yīng)答，是生物體收到刺激而引起DNA損傷時，機體為保護細胞免受傷害而啟動的DNA修飾；主要包括周期檢查點的激活、DNA損傷修復(fù)以及DNA損傷誘導(dǎo)的細胞凋亡[11]。細胞中用于修復(fù)DNA損傷的通路復(fù)雜多樣。當(dāng)DNA雙鏈斷裂時，損傷感受器立即進行損傷識別，采取同源重組修復(fù)和非同源末端連接的重組修復(fù)[12]。其中，ATM蛋白是參與細胞損傷識別和修復(fù)的關(guān)鍵點之一[13]，其通過上述兩種途徑參與DNA損傷應(yīng)答。當(dāng)ATM蛋白活化后，下游靶點CHK2發(fā)生磷酸化并激活p53[14]，引起細胞周期阻滯并誘導(dǎo)細胞凋亡[15]。其中，G1/S周期進程阻滯主要由p53誘導(dǎo)的細胞周期蛋白依靠性激酶抑制劑p21水平升高所造成[16]。流式細胞術(shù)及Western blot結(jié)果均表明，TG可通過上調(diào)p21水平并抑制周期相關(guān)蛋白CDK2、CDK4、CDK6、Cyclin D1和Cyclin E的表達，誘導(dǎo)細胞G0/G1期阻滯。

研究證明，ATM-CHK2-p53信號通路在DNA損傷誘導(dǎo)的細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[17]。結(jié)合其DNA損傷誘導(dǎo)作用，我們就TG對ATM-CHK2-p53信號通路的調(diào)控作用進行分子機制研究。Western blot實驗結(jié)果表明，TG給藥48 h后，細胞內(nèi)ATM和CHK2磷酸化水平顯著升高，且p53蛋白表達及其磷酸化水平也顯著上調(diào)。同時，我們對細胞內(nèi)凋亡標志蛋白cleaved PARP及cleaved Caspase 3進行檢測后發(fā)現(xiàn)，兩者細胞內(nèi)表達水平隨給藥濃度增大而顯著升高，證明TG對結(jié)直腸癌細胞具有凋亡誘導(dǎo)作用。由此可以推測，TG處理后細胞內(nèi)活化的ATM可能通過誘導(dǎo)其下游蛋白CHK2磷酸化，并進一步激活p53，引起p53介導(dǎo)的細胞凋亡。

細胞周期抑制在抗結(jié)直腸癌細胞增殖中發(fā)揮重要作用[18]。細胞周期蛋白(Cyclin)和細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)在細胞周期進程中通過形成CDK-Cyclin復(fù)合物，磷?；繕说鞍讓崿F(xiàn)細胞周期的調(diào)控[19]。其中，CDK2-Cyclin E和CDK4/6-Cyclin D1對于細胞由G1期轉(zhuǎn)入S期具有重要作用，而p21對于這一周期轉(zhuǎn)化進程具有抑制作用[20]。由于TG可通過ATM-CHK2-p53信號通路上調(diào)p53活性，活化后的p53可能通過激活p21從而啟動G1/S期監(jiān)測點，誘導(dǎo) G0/G1期細胞周期阻滯。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，TG對結(jié)直腸癌細胞具有增殖抑制作用且誘導(dǎo)細胞G0/G1期阻滯與凋亡。此外，TG可引起細胞DNA損傷，激活A(yù)TM-CHK2-p53信號通路。因此提示TG可能通過調(diào)控ATM-CHK2-p53信號通路，誘導(dǎo)p53介導(dǎo)的周期阻滯與細胞凋亡，抑制結(jié)直腸癌細胞增殖。本研究為通關(guān)藤苷G治療結(jié)直腸癌提供了一定理論基礎(chǔ)，其他相關(guān)作用機制有待進一步的研究。