董家吏，廖岳婷，焦必寧，蘇學(xué)素

1西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所(西南大學(xué)柑桔研究所)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，重慶 400712

黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)在植物界普遍存在的天然苯并-γ-吡喃酮衍生物，具有抗菌[1]、抗氧化[2]、免疫調(diào)節(jié)，化學(xué)預(yù)防和抗癌特性[3]，對(duì)人體健康大有益處。柚皮素作為一種二氫黃酮類(lèi)化合物，也具有抗菌[4]、抗腫瘤[5]、抗氧化[6,7]等生物活性。Tutunchi和Filippin等[8,9]研究了柚皮素抗擊COVID-19的可行性機(jī)制。柚皮素可與Vc、Ve聯(lián)用能更有效的治療鎘誘導(dǎo)和砷誘導(dǎo)的Wistar大鼠的氧化應(yīng)激引起的肝損傷[10,11]。但由于柚皮素自身的脂溶性和水溶性都較差，導(dǎo)致其生物利用率不高。因此柚皮素的改性研究受到各界的廣泛關(guān)注。

柚皮素的7位、4′位的酚羥基，以及4位的羰基較為活潑，因此可以通過(guò)化學(xué)反應(yīng)修飾柚皮素的結(jié)構(gòu)，改善其水溶性進(jìn)而改善其生物利用率。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，酰肼類(lèi)化合物具有良好的抗氧化活性[12,13]、抗菌活性[14]、抗癌活性[15]等，但由于酰肼中氨基的影響，對(duì)有機(jī)體有一定的毒性，因此將酰肼通過(guò)改造得到酰腙是改善酰肼毒性的有效手段[14]。酰腙類(lèi)化合物同樣具有良好的抗菌[16-18]、抗氧化[19,20]、抗增殖[21]等。因此，在現(xiàn)有關(guān)構(gòu)效關(guān)系以及柚皮素改性研究的基礎(chǔ)上，本文在4位引進(jìn)酰肼基團(tuán)形成酰腙，期望能得到既有生物活性，又能降低酰肼結(jié)構(gòu)毒性的柚皮素衍生物。對(duì)所得衍生物進(jìn)行體外抗氧化活性，以及其對(duì)HEK293細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，以篩選高抗氧化活性及低毒性物質(zhì)，為進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

圖1 柚皮素的結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

柚皮素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，源葉生物)；肼基甲酸芐酯(畢得醫(yī)藥)；2-氯苯甲酰肼(Aladdin)；2-硝基苯酰肼(Macklin)；苯乙酸肼(源葉生物)；3-甲氧基苯酰肼(HAWN)；4-氨基苯甲酰肼(源葉生物)；2-呋喃苯甲酰肼(畢得醫(yī)藥)；戊酰肼(畢得醫(yī)藥)；3-溴苯甲酰肼(源葉生物)；3-羥基苯甲酰肼(Alfa Aesar)；煙酰肼(Adamas-beta)；2-溴苯甲酰腙(Macklin)；2，4-二羥基苯甲酰肼(Macklin)；無(wú)水乙醇(HPLC，Knowles)；乙酸(AR)；乙酸乙酯(AR，成都市克隆化學(xué)品有限公司)；石油醚(AR，成都市克隆化學(xué)品有限公司)；硅膠；DMF(AR，重慶川東化工有限公司)；DMSO(Merck)；血清(康源生物)；雙抗(Gibco)去離子水。

具有快速ABTS[2，2′-疊氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)](S0121)和FRAP[血漿鐵還原能力](S0116)檢測(cè)能力的試劑盒購(gòu)自Beyotime biotechnology company(上海，中國(guó))；DPPH[1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基]自由基清除能力試劑盒(G0128W)；CCK-8試劑盒(abbkine)；HEK293細(xì)胞(珠海凱瑞生物科技有限公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

RE-52AA旋蒸儀(上海亞榮生化儀器廠(chǎng))；SZCL-3A磁力攪拌器(鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；M1-L213C微波爐(美的)3020-352酶標(biāo)儀(Thermo fisher scientific)；SGWX-4顯微熔點(diǎn)儀(儀電物光)；TGL-16c臺(tái)式離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)(AIRTECH)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo)；D1008E掌上離心機(jī)(SCILOGEX)；96孔板(NEST)。

1.2 柚皮素酰腙類(lèi)衍生物的合成方法

衍生物a～f、h～m的合成方法。取1.5 mmol柚皮素和1.5 mmol酰肼類(lèi)化合物于圓底燒瓶中，加入20 mL乙醇，2 mL乙酸溶解。將混合溶液在700 W微波爐中加熱4～5 min，TLC跟蹤反應(yīng)。由于4-氨基苯酰肼與柚皮素微波加熱不反應(yīng)，因此衍生物g的合成方法為稱(chēng)取1.5 mmol柚皮素和1.5 mmol 4-氨基苯酰肼類(lèi)化合物于圓底燒瓶中，加入20 mL乙醇，2 mL乙酸溶解。將混合溶液在110 ℃回流8～12 h，TLC跟蹤反應(yīng)。薄層色譜顯示混合物中除反應(yīng)物以外，有產(chǎn)物點(diǎn)，說(shuō)明有新化合物生成。反應(yīng)所得混合物用乙酸乙酯和石油醚作洗脫液分離，或用無(wú)水乙醇重結(jié)晶，得到衍生物純品。通過(guò)1H NMR及HR-EI-MS等方法確定衍生物結(jié)構(gòu)。化合物的合成路線(xiàn)如圖2所示。

圖2 13種衍生物合成路線(xiàn)及結(jié)構(gòu)

1.3 體外抗氧化活性的測(cè)定

1.3.1 ABTS法測(cè)定體外抗氧化活性

參考Hua等[22]的方法對(duì)柚皮素衍生物以及BHT、BHA兩種食品添加的抗氧化劑進(jìn)行了抗氧化活性測(cè)定。將所有樣品取0.01 mmol，溶于10 mL DMF得到1 mM的溶液，備用。將試劑盒中的10 mM的Trolox溶液稀釋為1.5、1.2、0.9、0.6、0.3、0.15 mM。使用具有ABTS檢測(cè)功能的總抗氧化劑含量測(cè)定試劑盒，確定總抗氧化劑活性。96孔板中每個(gè)檢測(cè)孔中加入20 μL過(guò)氧化物酶工作液，空白對(duì)照孔中加入10 μL蒸餾水；標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)檢測(cè)孔加入10 μL各種濃度的Trolox溶液，樣品檢測(cè)孔加入10 μL各種樣品溶液。每個(gè)孔再加入170 μL ABTS工作液，輕輕混勻，在室溫孵育6 min，在414 nm的波長(zhǎng)下檢測(cè)其吸光度。每個(gè)樣品3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取平均值。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：

△A414=A414空白-A414標(biāo)準(zhǔn)

樣品：

△A414=A414空白-A414標(biāo)準(zhǔn)

1.3.2 FRAP法測(cè)定體外抗氧化活性

稱(chēng)取0.01 mmol化合物，溶于5 mL DMF，再加入5 mL去離子水得到1 mM的溶液，備用。稱(chēng)取2.78 mg FeSO4·7H2O用DMF∶H2O=1∶1溶解至1 mL，得到10 mM的溶液。用DMF∶H2O=1∶1的混合溶劑稀釋為1.5、1.2、0.9、0.6、0.3、0.15 mM的溶液備用。96孔板的每個(gè)檢測(cè)孔中加入180 μL FRAP工作液；空白對(duì)照加入5μL 1∶1的DMF和H2O的混合溶劑；標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)檢測(cè)孔加入5 μL不同濃度的FeSO4·7H2O溶液；樣品檢測(cè)孔中加入5 μL樣品溶液；37 ℃ 孵育3～5 min后在593 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。每個(gè)樣品3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取平均值。

1.3.3 DPPH自由基清除能力測(cè)定

稱(chēng)取化合物2 mg溶于10 mL DMF中，得到200 μg/mL的藥液，備用。用甲醇配制500 μg/mL的Trolox溶液。再用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)品按0、5、10、15、20、25 μg/mL的濃度梯度稀釋?zhuān)瑐溆?。將各種藥液用80%甲醇水，稀釋至20 μg/mL，分別吸取藥物稀釋液150 μL于1.5 mL離心管中，再加入150 μL DPPH工作液，避光反應(yīng)30 min后，吸取反應(yīng)液200 μL于96孔板中，測(cè)定517 nm波長(zhǎng)的吸光度。每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取平均值。

化合物自由基清除率的計(jì)算：

化合物的自由基清除能力是于Trolox的濃度(μg/mL)來(lái)評(píng)估：

自由基清除率=0.351×(清除率-0.708 4)

1.4 細(xì)胞毒性測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為HEK293細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)前需先做預(yù)實(shí)驗(yàn)。在96孔板中加100 μL細(xì)胞密度分別為1×103、2×103、3×103、4×103、5×103、1×104的三組HEK293細(xì)胞，以及一個(gè)空白對(duì)照，一共63個(gè)孔。然后將板放在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。再向96孔板的每個(gè)孔中加入10 μL CCK-8溶液。在培養(yǎng)箱中將平板孵育1～4 h，并每隔1 h使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的吸光度。結(jié)果顯示當(dāng)293細(xì)胞數(shù)量為1×104細(xì)胞/孔、孵育時(shí)間為2.5 h，吸光值的結(jié)果接近1.0，符合預(yù)期。因此，選取的最佳細(xì)胞數(shù)量為1×104細(xì)胞/孔，孵育的最佳時(shí)間為2.5 h。

正式實(shí)驗(yàn)，在96孔板中的加100 μL 1×104細(xì)胞/孔293細(xì)胞懸液，將板在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h，在平板中加入培養(yǎng)基稀釋過(guò)的不同濃度的待測(cè)藥物。每種藥物的濃度梯度設(shè)置為：0、25、50、100、250、500 μmol/L、空白對(duì)照(不含細(xì)胞的培養(yǎng)液)、陰性對(duì)照(DMSO終濃度為1%)，每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔。藥物用DMSO溶解，其中DMSO終濃度為1%。在培養(yǎng)箱中孵育48 h，向96孔板的每個(gè)孔中加入10 μL CCK-8溶液。在培養(yǎng)箱中將平板孵育80 min。使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm波長(zhǎng)的吸光度。

細(xì)胞存活率的計(jì)算：

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物表征結(jié)果

2.2 抗氧化活性

由圖3、4、5可得，合成的13種衍生物對(duì)ABTS、FRAP、DPPH三種自由基的清除能力均強(qiáng)于柚皮素。結(jié)合三種測(cè)試方法，8種衍生物b、e、g、i、j、k、l、m的抗氧化活性顯著強(qiáng)于柚皮素。并且g、k兩種衍生物在三種方法下均表現(xiàn)出強(qiáng)的抗氧化活性，與BHT的抗氧化活性接近。

圖3 BHT、BHA、柚皮素和13種衍生物對(duì)ABTS自由基的清除能力

圖4 BHT、BHA、柚皮素和13種衍生物對(duì)FRAP自由基的清除能力

圖5 BHT、BHA、柚皮素和13種衍生物對(duì)DPPH自由基的清除能力

2.3 黃酮類(lèi)化合物的抗氧化活性構(gòu)效關(guān)系分析

黃酮類(lèi)化合物的抗氧化活性與黃酮環(huán)上的羥基密切相關(guān)，柚皮素5位、7位和4′位的酚羥基是其抗氧化活性的活性基團(tuán)，本文所得的13種衍生物抗氧化活性均強(qiáng)于柚皮素，推測(cè)其構(gòu)效關(guān)系如下：(1)合成的衍生物都具有酰腙結(jié)構(gòu)，酰腙結(jié)構(gòu)具有良好的抗氧化活性[20]，合成的衍生物抗氧化活性均強(qiáng)于柚皮素；(2)體外抗氧化活性測(cè)定顯示，f的自由基清除能力弱于其余衍生物，推測(cè)原因是f?；B基團(tuán)為烷基，只有較弱的超共軛效應(yīng)，其余衍生物酰基所連基團(tuán)為苯環(huán)，具有一定程度的共軛作用。此外，若?；粗苯优c苯環(huán)相連(如a、d)，自由基清除能力也相對(duì)較弱。推測(cè)原因是參與共軛的原子數(shù)目有限；(3)苯環(huán)連接的給電子基團(tuán)使得生成的自由基更穩(wěn)定，因此，當(dāng)苯環(huán)連接給電子基團(tuán)時(shí)，苯環(huán)上電子云密度增加，自由基的穩(wěn)定性增加，因此衍生物j～m的抗氧化活性較c更強(qiáng)；(4)化合物中酚羥基的個(gè)數(shù)顯著影響其抗氧化活性[23]，衍生物k、l的抗氧化活性明顯強(qiáng)于柚皮素，因k含有5個(gè)酚羥基，其抗氧化活性強(qiáng)于其他化合物；(5)由圖3、4、5的結(jié)果顯示，衍生物g與b、h、i等衍生物相比，抗氧化活性相對(duì)較好，因其修飾基團(tuán)的苯環(huán)上具有給電子基團(tuán)氨基，使其抗氧化活性增強(qiáng)；(6)ABTS、FRAP、DPPH三種體外抗氧化活性測(cè)定結(jié)果都顯示h與i相比，i的自由基清除能力較強(qiáng)，因此，對(duì)于單取代的溴原子，間位具有較弱的誘導(dǎo)效應(yīng)，因而較鄰位有更強(qiáng)的抗氧化活性。

2.4 細(xì)胞毒性結(jié)果

綜上所述，8種衍生物的抗氧化活性顯著強(qiáng)于柚皮素，具有很好的研究前景。因此測(cè)定了柚皮素和8種衍生物對(duì)于HEK293細(xì)胞的細(xì)胞毒性。各衍生物在不同濃度下，HEK293細(xì)胞存活率如表1所示，各衍生物的IC50結(jié)果如圖2所示。

表1 不同濃度柚皮素和衍生物對(duì)于HEK293細(xì)胞存活率的影響

檢測(cè)結(jié)果顯示，在0～500 μmol/L 的范圍內(nèi)，HEK293細(xì)胞存活率均隨衍生物濃度的增大而減小，具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)條件下細(xì)胞存活率大于90%，可認(rèn)為衍生物對(duì)細(xì)胞無(wú)抑制[24]。由表1可得，除e、m外，其余衍生物在0～25 μmol/L的濃度范圍內(nèi)細(xì)胞無(wú)抑制作用；g、k、l在0～50 μmol/L濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率大于90%，可以認(rèn)為這3種化合物在0～50 μmol/L的范圍內(nèi)對(duì)HEK293細(xì)胞無(wú)抑制作用；j在0～100 μmol/L濃度范圍內(nèi)時(shí)，細(xì)胞存活率仍大于90%。而柚皮素在0～250 μmol/L的濃度范圍內(nèi)細(xì)胞存活率仍在90%以上，比8種衍生物的細(xì)胞毒性都要低。圖6為柚皮素和8種化合物的IC50值，結(jié)果顯示，衍生物j在相同條件下，對(duì)HEK293細(xì)胞的毒性較小，并且毒性與柚皮素最為接近，衍生物g、k、l三種衍生物對(duì)HEK293細(xì)胞的毒性次之。

圖6 柚皮素和8種衍生物作用HEK293細(xì)胞的IC50

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用微波輔助的方式合成了13種柚皮素酰腙類(lèi)衍生物，其中有12種未被文獻(xiàn)報(bào)道。通過(guò)ABTS、FRAP、DPPH三種方法測(cè)定了13種衍生物的體外抗氧化活性。所得衍生物抗氧化活性均強(qiáng)于柚皮素。且8種衍生物b、e、g、i、j、k、l、m的抗氧化活性效果尤為顯著，且g、i、j、k、l、m等衍生物的抗氧化活性與BHT相當(dāng)，說(shuō)明柚皮素4位羰基通過(guò)反應(yīng)引入酰腙基團(tuán)能有效提高母體的抗氧化活性。對(duì)衍生物抗氧化活性進(jìn)行了構(gòu)效關(guān)系分析，顯示當(dāng)R基團(tuán)為吸電子基團(tuán)時(shí)，衍生物電荷密度分散，反應(yīng)所得的自由基中間體穩(wěn)定性增加，導(dǎo)致其抗氧化活性強(qiáng)于柚皮素本身。活性較強(qiáng)的8種衍生物對(duì)HEK293細(xì)胞存活率的影響結(jié)果顯示，除e、m外，其余衍生物在0～25 μmol/L的濃度范圍內(nèi)對(duì)HEK293表現(xiàn)為無(wú)毒。衍生物j對(duì)細(xì)胞無(wú)毒的濃度范圍在0～100 μmol/L，而衍生物g、k的檢測(cè)結(jié)果顯示，濃度為0～50 μmol/L的范圍內(nèi)，仍有大量細(xì)胞存活。但所得衍生物的細(xì)胞毒性均強(qiáng)于柚皮素，可見(jiàn)在引入酰腙基團(tuán)增加抗氧化活性的同時(shí)，還是不同層度的增加了化合物的細(xì)胞毒性。這為各衍生物后續(xù)研究中的添加劑量提供了參考依據(jù)。因此，經(jīng)過(guò)初篩，衍生物g、j、k擁有良好的抗氧化活性，并且細(xì)胞毒性較小，其中衍生物j既具有較強(qiáng)的抗氧化活性，又有較低的細(xì)胞毒性，具有一定的應(yīng)用前景。為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究提供了依據(jù)。對(duì)13種衍生物抗氧化活性的構(gòu)效關(guān)系分析，為以后的合成設(shè)計(jì)提供了方向。