孫麗芳，周 雪，汪 杰，李海池，葛發(fā)歡*

1廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州510006；2廣東省中藥超臨界流體萃取工程技術(shù)研究中心，廣州511458；3中山大學(xué)藥學(xué)院，廣州510006

紫莖澤蘭(EupatoriumadenophorumSpreng)為菊科澤蘭屬多年生半灌木狀草本植物，廣泛分布于中國(guó)云南等西南地區(qū)。紫莖澤蘭屬于外來(lái)入侵物種，從上世紀(jì)50年代左右傳入我國(guó)云南，繁殖能力極強(qiáng)，70 年代成為草害，給西南地區(qū)農(nóng)、林、牧業(yè)造成難以遏制的生態(tài)災(zāi)害[1]。為了有效控制紫莖澤蘭的蔓延，有學(xué)者進(jìn)行過(guò)機(jī)械、化學(xué)、生物防治等嘗試，雖然三種方法的結(jié)合運(yùn)用是有效的治理方式，但需要浪費(fèi)大量的人力、物力。因此,充分研究開(kāi)發(fā)與利用這一豐富的天然資源、變廢為寶成為解決紫莖澤蘭問(wèn)題的有效途徑。

云南藥用植物名錄曾記載，紫莖澤蘭全草具活血調(diào)經(jīng)、清熱解毒的功效，內(nèi)用可治感冒發(fā)熱、月經(jīng)不調(diào)、跌打腫痛，外用可治足癬、無(wú)名腫痛、外傷出血[2]。近年來(lái)，人們利用現(xiàn)代藥理的研究方法，對(duì)紫莖澤蘭的生物活性進(jìn)行研究，表明紫莖澤蘭具有抗菌[3,12]，抗病毒[4]、抗腫瘤[5]、抗氧化[6]以及殺蟲(chóng)[7]等活性。根據(jù)紫莖澤蘭傳統(tǒng)的調(diào)經(jīng)活血、解熱消腫的功效可推測(cè)，紫莖澤蘭可能有一定的抗炎活性，然而目前僅見(jiàn)一篇對(duì)紫莖澤蘭精油化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物的抗炎活性的報(bào)道[8]，紫莖澤蘭中固有的天然成分的抗炎活性還未見(jiàn)報(bào)道，研究紫莖澤蘭抗炎活性成分十分必要。本項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)曾采用新型提取分離技術(shù)對(duì)紫莖澤蘭提取、分離、純化等進(jìn)行過(guò)研究，得到了超臨界CO2萃取、超臨界CO2萃取-分子蒸餾富集等提取部位及2個(gè)澤蘭酮單體[9,10](單體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)，其中澤蘭酮類成分是超臨界CO2萃取部位、超臨界CO2萃取-分子蒸餾富集部位的主要成分。在此基礎(chǔ)上，本文對(duì)紫莖澤蘭的超臨界CO2萃取、分子蒸餾富集部位、甲醇提取部位的抗炎活性進(jìn)行體外評(píng)價(jià)，尋找抗炎有效成分，為該植物的資源利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

TDZ5-WS型離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-rad公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司)；XDS-1B型倒置顯微鏡(重慶重光實(shí)業(yè)有限公司)；DSX-280KB30型手提式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔板(美國(guó)Corning公司)；XS205 DuaL Range型百萬(wàn)分之一分析天平、十萬(wàn)分之一分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

紫莖澤蘭葉采自云南昆明市郊，由中山大學(xué)藥學(xué)院葛發(fā)歡教授鑒定為菊科植物紫莖澤蘭EupatoriumadenophorumSpreng．的葉，新鮮葉曬干。

euptox A(9-羰基-10，11-去氫澤蘭酮，純度≥98%)、9-oxoageraphorone(9-羰基-10-Hβ-澤蘭酮，純度≥98%)；甲醇提取物(MSE，澤蘭酮含量>8%)、超臨界CO2提取物(SFE，澤蘭酮含量>60%)、超臨界CO2萃取-分子蒸餾提取物(MDE，澤蘭酮含量>80%)，均為葛發(fā)歡團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室自制；槲皮素對(duì)照品(純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司)；脂多糖(LPS，Sigma公司)；一氧化氮(NO)檢測(cè)試劑盒(碧云天生物公司)；小鼠TNF-αELISA試劑盒(索萊寶)；DMEM培養(yǎng)基、PBS溶液、血清、0.25%胰酶、二甲基亞砜(DMSO)、青霉素-鏈霉素溶液等均來(lái)自美國(guó)Gibco公司；色譜級(jí)甲醇均來(lái)自美國(guó)Merck公司；小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7來(lái)自中山大學(xué)藥學(xué)院。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 紫莖澤蘭提取物的制備

按照文獻(xiàn)[9]，各個(gè)提取物的制備方法如下所述：

甲醇提取：精密稱取紫莖澤蘭干燥葉2.0 g，加入40 mL甲醇,室溫超聲提取30 min，提取液離心后，旋蒸，蒸干，計(jì)算收率。

超臨界提取法：將紫莖澤蘭葉粉碎，取300 g粉末，物料粒度80目，萃取溫度50 ℃、萃取壓力30 MPa、分離釜Ⅰ溫度40 ℃、分離釜Ⅰ壓力17 MPa，萃取2 h，即得。

超臨界CO2萃取-分子蒸餾提取物：取一定量預(yù)熱過(guò)的紫莖澤蘭超臨界萃取物加入進(jìn)料口，保持進(jìn)料口溫度為35 ℃(保證樣品流動(dòng)性)蒸發(fā)溫度133.99 ℃，真空度23.76 Pa，刮膜轉(zhuǎn)速300 rpm，得到分子蒸餾二級(jí)產(chǎn)物。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力

采用MTT法檢測(cè)紫莖澤蘭各個(gè)提取物及單體對(duì)小鼠單核巨噬細(xì)胞增殖活力的影響，篩選有效且安全的質(zhì)量濃度。調(diào)整細(xì)胞濃度為6×104/mL接種至96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁，吸去培養(yǎng)液，加入不同濃度的藥液作為給藥組，另設(shè)空白組(只加培養(yǎng)液)和陰性對(duì)照組(含有細(xì)胞和培養(yǎng)液)，培養(yǎng)48 h后，避光加20 μL的MTT(5 mg/mL PBS溶液)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)結(jié)束后，吸去上清，每孔加入150 μL DMSO，充分振蕩10 min，使用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測(cè)吸光值。

2.3 Griess法檢測(cè)小鼠單核巨噬細(xì)胞NO釋放量

采用LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥模型評(píng)價(jià)紫莖澤蘭各提取物及單體抗炎活性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，空白培養(yǎng)基清洗2遍，向其中加入適量的完全培養(yǎng)基，吹打均勻，于細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，加入完全培養(yǎng)基后將細(xì)胞稀釋至濃度為5×105/mL，接種至96孔板，每孔100 μL，過(guò)夜培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，吸去培養(yǎng)液，每孔加入經(jīng)培養(yǎng)基稀釋至終濃度的待測(cè)樣品，分為L(zhǎng)PS組(陰性對(duì)照組)，LPS+給藥組，LPS終濃度均為1 μg/mL，空白組加入完全培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔(0.2 mL/每孔)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，在新的96孔板每孔加入50 μL培養(yǎng)液上清后，按炎癥因子試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定NO 的釋放量。用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值(波長(zhǎng)540 nm),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由GraphPad Prism 7 生物統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件計(jì)算藥物對(duì)RAW細(xì)胞炎癥因子NO釋放抑制率IC50值。

2.4 ELISA法檢測(cè)小鼠單核巨噬細(xì)胞TNF-α釋放量

RAW264.7細(xì)胞接種密度為2×104/孔，其他操作與“2.3”相同，收集每孔細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作來(lái)測(cè)定各組培養(yǎng)孔內(nèi)細(xì)胞上清液中炎性因子TNF-α的表達(dá)水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，數(shù)據(jù)以Mean ± SD表示，組間數(shù)據(jù)對(duì)比采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，將數(shù)據(jù)通過(guò)Graphpad Prism 7.0繪圖軟件制作成直方圖的形式表現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 紫莖澤蘭提取物澤蘭酮類成分含量

按照文獻(xiàn)[9,10]，為了便于直觀分析比較各提取物抗炎活性與澤蘭酮類成分的關(guān)系，本研究所提供實(shí)驗(yàn)樣品的含量匯總?cè)缦?，?jiàn)表1。

3.2 細(xì)胞活力分析

與陰性對(duì)照組相比，三個(gè)提取物質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，甲醇提取物(MSE)、超臨界CO2提取物(SFE)、超臨界CO2萃取-分子蒸餾提取物(MDE)細(xì)胞增殖活力均大于95%，見(jiàn)圖2，說(shuō)明三個(gè)提取物的質(zhì)量濃度≤100 μg/mL的提取物藥液對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性沒(méi)有顯著性差異；兩個(gè)單體摩爾濃度為300 μmol/L時(shí)，euptox A、9-oxoageraphorone的細(xì)胞增殖活力均大于90%，說(shuō)明摩爾濃度≤300 μmol/L的單體藥液對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活性沒(méi)有顯著性差異。綜上，三個(gè)提取部位在小于100 μg/mL的藥液濃度是安全濃度范圍，兩個(gè)單體在小于300 μmol/L的濃度范圍是安全濃度范圍。

圖2 紫莖澤蘭各成分對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞增殖活力的影響

3.3 紫莖澤蘭三個(gè)提取物的抗炎活性

3.3.1 紫莖澤蘭提取物對(duì)炎癥因子TNF-α的影響

經(jīng)ELISA法檢測(cè)，與對(duì)照組相比，LPS組細(xì)胞上清液中TNF-α含量顯著增高(P<0.05)；20 μmol/L的槲皮素為陽(yáng)性對(duì)照，TNF-α的釋放量為21 722.55 pg/mL。三個(gè)提取物的不同濃度的給藥組，與LPS共同處理24 h后，RAW264.7分泌TNF-α炎癥因子較LPS組均減少，且隨著各個(gè)提取物濃度的增加，炎癥因子TNF-α減少更加明顯，說(shuō)明SFE、MDE、MSE對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞分泌TNF-α均起到抑制作用，見(jiàn)圖3。

圖3 紫莖澤蘭提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α表達(dá)的影響

3.3.2 紫莖澤蘭提取物對(duì)炎癥因子NO的影響

本實(shí)驗(yàn)利用LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞，構(gòu)建體外炎癥模型，采用格里斯試劑法(Griess)檢測(cè)細(xì)胞上清液中一氧化氮(NO)的分泌量。在確定不同提取物的無(wú)毒性劑量范圍后，研究了不同提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞NO生成量的影響，當(dāng)細(xì)胞不受外界刺激時(shí)，細(xì)胞基本不表達(dá)NO，在終濃度為1 μg/mL LPS刺激24小時(shí)后，巨噬細(xì)胞釋放出大量的NO。由圖4可知，LPS組的NO釋放量均顯著高于對(duì)照組(P<0.001)，表明造模成功。在測(cè)定中，以槲皮素為陽(yáng)性對(duì)照(半抑制濃度IC50=14.23 μmol/L)，與LPS組相比，質(zhì)量濃度在5～100 μg/mL的三個(gè)提取部位的藥液濃度均可降低NO釋放量，且具有劑量依賴性。

由圖4A可知，與模型組相比，SFE藥液在質(zhì)量濃度為5、10、15、25、50、100 μg/mL對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO生成量顯著低于模型組(P< 0.05)，NO的釋放量隨著藥液濃度的增加而降低，IC50值為32.22 μg/mL。結(jié)果說(shuō)明，SFE部位抗炎活性明顯，超臨界提取物的抗炎活性與提取物濃度呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系。

由圖4B結(jié)果可知，不同濃度的MDE藥液對(duì)RAW 264.7細(xì)胞均有不同程度的NO抑制作用(P<0.01)，且當(dāng)MDE藥液的質(zhì)量濃度大于50 μg/mL時(shí)，NO抑制率大于60%，IC50值為31.59 μg/mL。說(shuō)明MDE部位有較明顯的抗炎活性，MDE部位的抗炎活性隨藥液濃度的升高而升高。

由圖4C可知，與模型組相比，各濃度MSE藥液顯著降低NO釋放量(P< 0.05)。質(zhì)量濃度大于25 μg/mL的MSE藥液能顯著降低NO的釋放量(P<0.001)，且隨著藥液濃度的增加，NO的釋放量越低，IC50值為50.38 μg/mL。結(jié)果說(shuō)明，甲醇提取物有一定的抗炎活性，與提取物濃度呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系。

圖4 紫莖澤蘭提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的NO表達(dá)的影響

綜合以上研究結(jié)果，SFE、MDE、MSE的IC50值分別為32.22、31.59、50.38 μg/mL，說(shuō)明SFE、MDE的抗炎活性相似，并顯著高于好于MSE。根據(jù)課題組前期研究結(jié)果[9,10]可知，超臨界CO2萃取及其分子蒸餾富集部位中euptox A、9-oxoageraphorone為主要成分，SFE和MDE富含澤蘭酮類物質(zhì)，euptox A、9-oxoageraphorone這兩種澤蘭酮總量均在60%以上[9]，遠(yuǎn)高于MSE中的澤蘭酮的含量，而SFE、MDE抗炎活性明顯高于MSE的，因此推測(cè)，紫莖澤蘭的抗炎活性可能與澤蘭酮類物質(zhì)有關(guān)。因此，進(jìn)一步研究了澤蘭酮單體euptox A、9-oxoageraphorone的抗炎活性。

3.4 紫莖澤蘭單體euptox A、9-oxoageraphorone抗炎活性

3.4.1 Euptox A、9-oxoageraphorone對(duì)炎癥因子TNF-α的影響

由圖5可知，euptox A、9-oxoageraphorone的不同濃度的給藥組，與LPS共同處理24 h后，RAW264.7分泌TNF-α炎癥因子較LPS組均減少，且隨著各個(gè)提取物濃度的增加，炎癥因子TNF-α遞減，說(shuō)明euptox A、9-oxoageraphorone對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞分泌TNF-α均起到抑制作用。

圖5 化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的TNF-α生成量的影響

3.4.2 Euptox A、9-oxoageraphorone對(duì)炎癥因子NO的影響

按照上述提取物抗炎活性測(cè)定方法，對(duì)單體euptox A進(jìn)行了抗炎活性研究，結(jié)果見(jiàn)圖6A。當(dāng)摩爾濃度為25～300 μmol/L 時(shí)，euptox A藥液極顯著的降低NO的釋放量(P<0.001)。不同摩爾濃度的euptox A對(duì)RAW 264.7細(xì)胞NO的釋放均有抑制作用，且細(xì)胞中NO含量與提取物濃度有明顯的劑量依賴性，隨euptox A濃度的升高而降低。Euptox A的IC50值為69.98 μmol/L(16.23 μg/mL)，顯著低于三個(gè)提取物的IC50值，說(shuō)明euptox A有顯著的抗炎活性，且其抗炎活性優(yōu)于各個(gè)提取物。

圖6 化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的NO生成量的影響

由圖6B結(jié)果可知，當(dāng)摩爾濃度為50～300 μmol/L 時(shí)，9-oxoageraphorone藥液極顯著的降低NO的釋放量(P<0.001)。不同摩爾濃度的9-oxoageraphorone藥液對(duì)RAW 264.7細(xì)胞均有不同程度的NO抑制作用，9-oxoageraphorone藥液的抗炎活性在5～100 μmol/L濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性，從100 μmol/L 開(kāi)始進(jìn)入了平臺(tái)期。9-Oxoageraphorone的IC50值為43.14 μmol/L(10.09 μg/mL)，結(jié)果顯示澤蘭酮單體9-oxoageraphorone具有顯著的抗炎活性，其抗炎活性高于euptox A和三個(gè)提取物。

表2 紫莖澤蘭各個(gè)樣品的IC50值匯總

從以上研究結(jié)果可以看出，euptox A、9-oxoageraphorone兩個(gè)單體化合物均有顯著的抗炎活性，其中9-oxoageraphorone抗炎活性更強(qiáng)，說(shuō)明euptox A、9-oxoageraphorone是紫莖澤蘭中有效的抗炎成分之一。

4 小結(jié)與討論

基于體外細(xì)胞炎癥模型，本文首次對(duì)紫莖澤蘭超臨界CO2提取物、超臨界CO2萃取-分子蒸餾提取物、甲醇提取物三個(gè)提取部位以及euptox A、9-oxoageraphorone的抗炎活性進(jìn)行研究。從體外抗炎效果來(lái)看，超臨界CO2提取物和超臨界CO2萃取-分子蒸餾提取物表現(xiàn)出明顯的抗炎活性；超臨界CO2提取物和超臨界CO2萃取-分子蒸餾提取物富含澤蘭酮類成分，推測(cè)紫莖澤蘭的抗炎活性與澤蘭酮類物質(zhì)有關(guān)。Euptox A、9-oxoageraphorone單體化合物具有顯著的抗炎活性，且兩個(gè)單體均好于各個(gè)提取物。結(jié)果證明澤蘭酮類物質(zhì)有良好的抗炎活性，是紫莖澤蘭抗炎的有效成分之一。

本研究?jī)H探討了紫莖澤蘭超臨界CO2提取物和超臨界CO2萃取-分子蒸餾提取物以及主要的澤蘭酮單體化合物euptox A、9-oxoageraphorone的體外抗炎活性，紫莖澤蘭中可能還含有少量9-羰基-12-羥基-10，11-去氫澤蘭酮、9β-羥基澤蘭酮、9-羥基澤蘭酮乙酸酯等多種結(jié)構(gòu)相似的澤蘭酮類化合物[11]，其他澤蘭酮成分的體內(nèi)外抗炎活性及抗炎機(jī)制值得深入系統(tǒng)研究。