楊思琪，張長城，馬瓊艷，尤 旭，楊 圓，張 艷，袁 丁，趙海霞

三峽大學醫(yī)學院，宜昌 443002

隨著經(jīng)濟社會的不斷發(fā)展及人們生存壓力的不斷提高，不孕不育已成為一個全球性問題。研究發(fā)現(xiàn)，全世界約有15%的夫婦患有不育癥，其中男性因素約占50%，而其機制尚不十分清楚[1]。睪丸支持細胞作為唯一與生精細胞相連的體細胞，在結構上包繞精原干細胞、精原細胞及各級生精細胞，通過多種緊密連接蛋白如閉合蛋白(Occludin)和密封蛋白-1(Claudin-1)等形成血睪屏障[2]。研究顯示，睪丸支持細胞分泌各種生長因子如膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)、骨形成蛋白4(bone morphogenetic protein-4，BMP4)和干細胞因子(stem cell factor，SCF)等，調(diào)控精原干細胞增殖分化，促進精子形成[3]。另有研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期暴露于六價鉻的雄性大鼠成年后支持細胞緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1表達下調(diào)，導致生精細胞凋亡增多，精子生成障礙[4]。在熱應激刺激下，牛睪丸支持細胞發(fā)生損傷，GDNF、SCF mRNA水平下調(diào)，致使精子發(fā)生障礙。因此，改善支持細胞結構和功能可能是治療男性不育癥的新方向。

淫羊藿是我國傳統(tǒng)補益中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補腎陽，強筋骨，祛風濕的功效?，F(xiàn)代藥理研究顯示淫羊藿具有顯著的延緩衰老和增強雄性生殖功能的作用，其主要活性成分為淫羊藿苷(icariin，ICA)。研究發(fā)現(xiàn)，ICA可促進大鼠原代Sertoli 細胞的增殖，增強雄性大鼠Sertoli細胞的功能[5]。研究顯示，ICA可通過升高支持細胞卵泡刺激素受體和緊密連接蛋白Claudin-11 mRNA表達水平，提高睪丸組織的抗氧化應激能力，從而增強大鼠生殖功能[6]。核因子紅細胞相關因子2(nuclear factor erythroid like 2，Nrf2)作為機體細胞防御系統(tǒng)的主要管理者，通過與抗氧化反應原件(antioxidant response element，ARE)的基因啟動子調(diào)控區(qū)域中的增強子序列結合，調(diào)節(jié)一系列編碼抗氧化蛋白和氧化應激反應蛋白等基因的表達，協(xié)調(diào)對各種應激條件和有害攻擊的微調(diào)反應，實現(xiàn)細胞微環(huán)境穩(wěn)態(tài)[7.8]。研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿可通過激活Nrf2減輕氧化應激介導的肝損傷[9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ICA可通過上調(diào)Nrf2減輕自然衰老大鼠睪丸生殖細胞DNA損傷。ICA可上調(diào)D-Gal誘導小鼠睪丸支持細胞株TM4細胞緊密連接相關蛋白Occludin和Claudin-1的蛋白表達。然而，ICA能否通過Nrf2信號通路改善D-Gal導致的15P-1細胞損傷，目前尚未見研究報道。前期研究顯示，D-Gal可以誘導的小鼠睪丸支持細胞株TM4細胞緊密連接損傷。因此，本實驗以D-半乳糖(D-galactose，D-Gal)誘導的15P-1細胞為損傷模型，從Nrf2信號通路探討ICA對支持細胞損傷的保護作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細胞株

小鼠睪丸支持細胞株15P-1細胞購自上海通派生物細胞庫。

1.1.2 藥物及試劑

DMEM、0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司)；胎牛血清(Science Cell公司)；D-Gal(Sigma公司)；ICA單體(成都植標化純生物技術有限公司)，純度98.61%。總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒(大連寶生物科技有限公司)；PCR擴增試劑(Thermo Scientific公司)；PCR相關引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；ECL顯影液(碧云天生物技術研究所)；β-actin(4970L，美國Cell Signaling Technology公司)；醌氧化還原酶-1[NAD(P)H quinone oxidoreductase-1，NQO-1](GB11282)、血紅素氧化酶1(heme oxygenase-1，HO-1)(10701-1-AP)(武漢谷歌生物科技有限公司)；GDNF(ab18956)、BMP4(ab39973)、Nrf2(ab31163)(美國Abcam公司)；SCF(sc-13126)、Occludin(sc-5562)、Claudin-1(sc-166338)(美國Santa Cruze公司)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗鼠IgG、HRP標記的山羊抗兔二抗(武漢科瑞有限公司)。

1.1.3 主要儀器

CKX41型光學倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；FORMA series Ⅱ二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；SW-4T-2F型超凈工作臺(上海博訊實業(yè)公司醫(yī)療設備廠)；TD25-WS型臺式低速離心機(湖南省湘儀儀器有限公司)；Centrifuge 5424 R型高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；HVA-85型高壓滅菌鍋(日本Hirayama公司)；NANODROP 200型核酸蛋白檢測儀(美國Thermo Scientific公司)；StepOne Plus型PCR擴增儀(美國Applied Biosysterms公司)；Gellogic 212型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Kodak公司)；Power Pac TM Basic電泳儀(美國Bio-Rad公司)；Bioshine Chemic Q 4800化學發(fā)光凝膠成像自動顯影儀(上海歐翔科學儀器有限公司)；A1R+激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 15P-1細胞培養(yǎng)

復蘇15P-1細胞，用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取處于對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2.2 15P-1細胞分組及處理

前期我們采用100和150 mM D-Gal刺激15P-1細胞，Western blot及半定量PCR檢測相關指標，進行模型條件的摸索，根據(jù)前期預實驗結果，我們選擇150 mM D-Gal進行后續(xù)實驗。15P-1細胞按每孔5×104個/mL接種至六孔板中，分為對照組、D-Gal處理組、D-Gal+ICA(0.5 μM)組和D-Gal+ICA(1.0 μM)組。待細胞完全貼壁后，棄去培養(yǎng)基。Control組更換新鮮培養(yǎng)基，D-Gal處理組加入150 mM 的含D-Gal的培養(yǎng)基，D-Gal+ICA(0.5 μM)組加入含150 mM的D-Gal及0.5 μM ICA的培養(yǎng)基，D-Gal+ICA(1.0 μM)組加入含150 mM 的D-Gal及1.0 μM ICA的培養(yǎng)基刺激48 h。

1.2.3 MTT法篩選ICA適用濃度

將15P-1細胞按5×104個/mL的密度接種于96孔板，每孔100 μL。待細胞長出形態(tài)后，設置調(diào)零組、正常對照組(細胞+培養(yǎng)基)、D-Gal組、D-Gal+DMSO對照組、D-Gal+ICA組，每組5個復孔，給予不同濃度(0.125、0.25、0.5、1、2、4和8 μM)ICA預保護20 h后，吸去原培養(yǎng)基，正常對照組加入新配制的培養(yǎng)基，D-Gal處理組加入終濃度為150 mM D-Gal的新配制的培養(yǎng)基，D-Gal+ICA組加入終濃度為150 mM D-Gal及ICA終濃度為0.125、0.25、0.5、1、2、4和8 μM的新配制的培養(yǎng)基，刺激48 h后在每孔中加入終濃度為0.5 g/L MTT(5 g/L，PBS配制) 20 μL，繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h后去掉上清液，每孔加入150 μL DMSO后放在搖床上搖10 min后于酶標儀570 nm處測出OD值。最后通過細胞活力的計算公式：細胞活力=[A加藥組-A調(diào)零組]/[A正常對照組-A調(diào)零組] ×100%，計算出各組的細胞的活力。

1.2.4 RT-PCR檢測15P-1細胞相關因子GDNF、BMP4和SCF mRNA表達水平

將六孔板從培養(yǎng)箱中取出，吸除上清，每孔加入1 mL PBS洗滌細胞后，每組加入1 mL Trizol裂解液，提取總RNA。檢測其完整性，核酸儀測定其濃度，按逆轉錄試劑盒說明進行逆轉錄得cDNA，PCR反應體系為：12.5 μL 2×PCR Master mix，10.5 μL ddH2O，分別加入0.5 μL GDNF、BMP4和SCF上下游引物，最后加入1 μL cDNA模板，引物序列見表1。RT-PCR反應條件：①變性：94 ℃ 30 s；②退火：57 ℃ 30 s；③延伸：72 ℃ 30 s;共30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像儀拍照，用Image J軟件掃描條帶的吸光度(A)。

1.2.5 Western blot法檢測15P-1細胞功能相關蛋白GDNF、BMP4、SCF、Occludin和Claudin-1及Nrf2信號通路相關蛋白Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白表達水平

將六孔板從培養(yǎng)箱中取出，吸除上清，每孔加入1 mL PBS 洗滌細胞后，收集細胞。在收集好的各組細胞中加入100 μL裂解液，渦旋儀上劇烈振蕩30 s，冰盒中靜置15 min，共震蕩3次，使細胞充分裂解。經(jīng)4 ℃、12 000 rpm離心10 min后取上清，采用BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度，定量后的蛋白樣品加入上樣緩沖液，于100 ℃水浴變性10 min。將蛋白樣品進行電泳并轉印至PVDF膜，PVDF膜放置于50 g/L脫脂牛奶封閉液中室溫封閉1 h，分別加入鼠抗Claudin-1(1∶1 000)、兔抗Occludin(1∶2 000)、兔抗GDNF抗體(1∶1 000)、兔抗BMP4抗體(1∶1 000)、鼠抗SCF抗體(1∶1 000)、兔抗Nrf2抗體(1∶1 000)、鼠抗NQO-1抗體(1∶500)、兔抗HO-1抗體(1∶1 000)、兔抗 β-actin 抗體(1∶5 000)，4 ℃冰箱搖床孵育過夜；次日，TBST洗膜，加HRP標記的山羊抗鼠 IgG(1∶5 000)或HRP標記的山羊抗兔二抗(1∶3 000)，室溫孵育1 h；TBST洗膜。ECL化學發(fā)光于凝膠成像系統(tǒng)中顯影成像，用Image J軟件對結果進行灰度掃描分析。

1.2.6 免疫熒光檢測Nrf2表達及定位

將無菌圓形蓋玻片放入24孔板中，無菌PBS洗凈玻片上殘留的酒精，將GC-1細胞懸液接種到無菌玻片上。待GC-1細胞長出形態(tài)后，按照“1.2.3”處理細胞后棄掉上清，PBS洗滌細胞，每5 min更換一次PBS，共洗滌20 min。洗滌完成后，4%的多聚甲醛固定細胞30 min后PBS洗滌細胞，每5 min更換一次PBS，共洗滌20 min。后經(jīng)0.1% Triton X-100打孔15 min，PBS洗滌細胞，每5 min更換一次PBS，共洗滌20 min。1% BSA于溫度為25 ℃下封閉1 h，棄掉封閉液后，置于4 ℃冰箱孵育一抗。一抗孵育完成后，25 ℃復溫30 min以上，PBS洗滌細胞，期間每5 min更換一次PBS。于37 ℃的溫度下避光孵育熒光二抗1 h，用PBS洗滌細胞后，避光孵育DAPI(0.5 μg/mL)5 min，PBS洗滌后封片，共聚焦熒光顯微鏡下觀察取圖。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 ICA對15P-1細胞活力的影響

用不同濃度ICA處理15P-1細胞后，MTT法檢測細胞活力，結果如圖1所示，當ICA濃度在2.5 μM以下時，對正常細胞無明顯影響；將15P-1細胞分為對照組、150 mM D-Gal處理組、150 mM D-Gal +DMSO處理組、150 mM D-Gal加不同濃度ICA(0.125、0.25、0.5、1、2、4和8 μM)處理組，用MTT法檢測細胞活力。與D-Gal處理組相比，ICA濃度為0.5和1 μM時，對15P-1細胞活力有明顯的保護作用，因此后續(xù)我們選擇ICA用藥濃度為0.5和1 μM研究D-Gal誘導15P-1細胞損傷的保護作用。

2.2 ICA對15P-1細胞形態(tài)的影響

光鏡結果顯示，與對照組相比，D-Gal處理組中，15P-1細胞數(shù)量明顯減少，部分細胞形態(tài)不規(guī)則，而ICA干預后明顯改善(見圖2)。

圖2 ICA對15P-1細胞形態(tài)的影響(400×)

2.3 ICA對15P-1細胞相關因子GDNF、BMP4和SCF mRNA水平的影響

RT-PCR結果顯示，與對照組相比，D-Gal處理組GDNF、BMP4和SCF mRNA水平均顯著下調(diào)，提示D-Gal處理后，15P-1細胞功能下降，而給予ICA干預后，GDNF、BMP4和SCF的mRNA水平均顯著上升(見圖3)。

圖3 ICA對15P-1細胞相關因子GDNF、BMP4和SCF mRNA水平的影響

2.4 ICA對15P-1細胞相關因子GDNF、BMP4和SCF蛋白表達水平的影響

結果如圖4所示，與對照組相比，D-Gal處理組15P-1細胞因子GDNF、BMP4和SCF蛋白水平均顯著下調(diào)，而ICA干預后可顯著升高GDNF、BMP4和SCF蛋白水平，提示ICA可以改善D-gal所致15P-1細胞功能下降。

圖4 ICA對15P-1細胞相關因子GDNF、BMP4和SCF蛋白表達水平的影響

2.5 ICA對15P-1細胞緊密連接相關蛋白Occludin和Claudin-1蛋白表達水平的影響

與Control組比較，D-Gal可誘導15P-1細胞Occludin和Claudin-1蛋白水平的顯著下調(diào)，而ICA則可顯著上調(diào)Occludin和Claudin-1蛋白水平，提示ICA對D-Gal所致15P-1細胞緊密連接損傷有明顯的改善作用，結果見圖5。

圖5 ICA對15P-1細胞緊密連接相關蛋白Occludin和Claudin-1蛋白表達水平的影響

2.6 ICA對15P-1細胞Nrf2信號通路相關蛋白Nrf2、NQO-1和HO-1蛋白表達水平的影響

Western blot結果顯示，與正常對照組相比，D-Gal處理組15P-1細胞Nrf2信號通路相關蛋白Nrf2、NQO-1和HO-1蛋白表達水平顯著降低，而ICA干預后，15P-1細胞Nrf2信號通路相關蛋白Nrf2、NQO-1和HO-1蛋白表達水平均顯著上升(見圖6)。

圖6 ICA對 Nrf2信號通路相關蛋白Nrf2、HO-1和NQO-1的蛋白表達水平的影響

2.7 ICA對15P-1細胞中Nrf2表達及定位的影響

結果如圖7所示，與對照組相比，D-Gal處理組胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達水平明顯降低，而給予ICA干預后，胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達水平明顯上升。

圖7 ICA對15P-1細胞中Nrf2表達及定位的影響

3 討論

近年來，不育已被WHO確認為一個公共衛(wèi)生問題，在普通人群中發(fā)病率逐年增高，影響了全球約15%的育齡期夫婦[1]。調(diào)查研究顯示，在美國以及其他西方國家中，精子數(shù)量每年減少1.5%，據(jù)估計，全球近7 000萬對夫婦已成為不育癥或不育癥的受害者[10]。在WHO進行的一項大型流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，約有一半的夫婦不育是由男性因素造成的，而其機制尚不十分清楚[11]。

研究發(fā)現(xiàn)，D-Gal可使小鼠支持細胞系TM4細胞數(shù)量減少，細胞功能下降[12]。因此，我們選擇D-Gal模型來評估ICA是否能減輕15P-1細胞損傷。有文獻報道，35、70、140 μM ICA處理血管內(nèi)皮細胞ECV-304后，細胞抑制率為1.2%，無明顯細胞毒性。本實驗MTT結果顯示，與對照組相比，ICA單獨處理15P-1細胞時，濃度為40 μM時IC50大于50%，提示ICA無明顯細胞毒性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ICA對D-Gal處理TM4細胞損傷有保護作用，且在0.5和1 μM濃度下有明顯促增殖作用[13]。而本實驗MTT結果也顯示，與D-Gal處理組相比，ICA在0.125～1 μM以濃度依賴方式增加細胞存活率，在0.5和1 μM濃度下有明顯促細胞增殖作用，ICA濃度大于1 μM時促增殖作用較前減弱，可能是由于本實驗中D-Gal刺激15P-1細胞時間較長，細胞損傷較重，損傷的細胞對藥物刺激的敏感性大大增加，從而表現(xiàn)出低濃度促進，高濃度抑制的現(xiàn)象。

睪丸支持細胞是定位于睪丸生精小管內(nèi)與生精細胞直接相連的體細胞，通過分泌多種細胞因子如GDNF、BMP4及SCF等，調(diào)節(jié)精原干細胞的增殖分化，促進精子形成。GDNF是轉化生長因子β超家族的一員，是調(diào)節(jié)精原干細胞增殖的重要因子，在雄性動物生殖細胞發(fā)育和睪丸早期發(fā)育中發(fā)揮重要作用。BMP4和SCF是促進精原干細胞分化的重要因子[14]。本課題組前期研究顯示，淫羊藿總黃酮可上調(diào)自然衰老大鼠睪丸支持細胞分泌因子GDNF、BMP4及SCF mRNA和蛋白水平，改善支持細胞分泌功能[15]。結果顯示，與對照組相比，D-Gal處理后支持細胞分泌因子mRNA及蛋白表達水平均顯著下降，而給予ICA后15P-1支持細胞分泌因子mRNA及蛋白表達水平均顯著上調(diào)。提示ICA能改善15P-1睪丸支持細胞的分泌功能。

支持細胞間緊密連接是血睪屏障最重要的組成部分，主要包括Occludin、Claudin、黏附蛋白三個跨膜蛋白家族及閉鎖連接胞漿蛋白家族[16]，細胞間緊密連接不僅可以保護生殖細胞不受免疫系統(tǒng)的侵害，給精子發(fā)生提供一個良好的生理環(huán)境，而且還允許前細線期精母細胞和后細線期精母細胞規(guī)律的通過血睪屏障，以便進一步發(fā)育[17]。研究發(fā)現(xiàn)，Occludin和Claudin是最早被鑒定的緊密連接整膜蛋白[18]，而緊密連接能力和上皮屏障功能主要由Claudins介導。另有研究顯示，在大鼠睪丸內(nèi)注射合成的Occludin肽，可在27天后可逆的消融大部分精原細胞，而在體外敲除Occludin也會導致支持細胞緊密連接功能下降[19]。本實驗結果顯示，與對照組相比，D-Gal處理后15P-1細胞的緊密連接蛋白表達下降，而給予ICA后15P-1支持細胞緊密連接蛋白表達顯著上調(diào)。提示ICA對15P-1支持細胞緊密連接蛋白損傷有保護作用。

機體處于正常狀態(tài)下，Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein1，Keap1)募集Nrf2，在細胞質(zhì)中形成一種復合物經(jīng)泛素蛋白酶降解；當發(fā)生氧化應激時Nrf2與Keap1解離，Nrf2由胞質(zhì)轉移至胞核結合ARE，激活下游HO-1和NQO1等大量保護性基因的轉錄，進而抵抗各種刺激對機體產(chǎn)生的氧化應激損傷[20]。本課題組前期研究顯示，ICA可通過激活Nrf2/HO-1信號通路，減輕自然衰老大鼠睪丸DNA損傷，改善衰老所致的生殖功能衰退，提示ICA改善生精功能障礙可能與Nrf2信號通路有關。前期研究顯示，ICA可改善D-Gal誘導的睪丸支持細胞株TM4細胞損傷。因此，本研究采用Western blot法檢測Nrf2通路蛋白，研究結果顯示，與對照組相比，D-Gal刺激后15P-1細胞內(nèi)Nrf2通路重要蛋白Nrf2、HO-1和NQO-1的表達水平均顯著下調(diào)，而給予ICA后均顯著上升。隨后我們采用免疫熒光技術進一步檢測了Nrf2的表達及定位，與正常對照組相比，D-Gal處理組15P-1細胞中胞核內(nèi)Nrf2熒光表達減弱，而給予ICA后有所改善。以上結果提示，15P-1細胞功能和結構損傷與Nrf2信號通路下調(diào)進而導致細胞抗氧化能力下降有關，而ICA可能通過提高15P-1細胞抗氧化能力進而改善其損傷。

綜上所述，ICA可以通過激活Nrf2信號通路，上調(diào)15P-1細胞分泌相關蛋白GDNF、BMP4和SCF及緊密連接相關蛋白Occludin和Claudin-1的表達水平，進而改善D-Gal誘導的15P-1細胞損傷。本實驗為我們后續(xù)研究ICA對生殖細胞的保護作用及其機制奠定了一定的理論基礎，以期更好的發(fā)掘中草藥淫羊藿在生殖系統(tǒng)中的應用價值，同時為臨床上治療男性不育癥提供了新的方向。