唐思琪，羅 姣，黃 浩，吳賢哲，金倫喆，劉向前*，李小軍*

1贛南醫(yī)學院藥學院 國家中藥現(xiàn)代化工程技術研究中心客家中醫(yī)藥資源研究分中心，贛州 341000；2湖南中醫(yī)藥大學藥學院，長沙 410208；3圓光大學藥學院，韓國 益山 54538

糙葉五加Acanthopanaxhenryi(Oliv.) Harms為五加科五加屬植物，它是一種生長在海拔1 000～3 200 m的林緣或灌木叢中的落葉灌木或喬木。作為中國的特產(chǎn)植物，其廣泛分布于湖南、四川、安徽、浙江等地[1]。五加屬植物在中國、韓國、日本等國家的傳統(tǒng)醫(yī)藥中占有重要地位。它的干燥根皮和莖皮是著名的傳統(tǒng)藥物，民間常用于治療風濕、關節(jié)炎、癱瘓、筋骨痛等；其葉通常被作為茶飲或民間醫(yī)藥中的一種多功能蔬菜湯料食用[2]。糙葉五加根皮(也稱五加皮)收載于湖南省中藥材地方標準，具有祛風利濕、活血舒筋、理氣止痛等功效，主要用于治療風濕痹痛、拘攣麻木、筋骨痞軟、水腫、跌打損傷、疝氣腹痛等[3]。在我們的前期研究中，從糙葉五加的果實、葉、根、根皮、莖及花中分離鑒定出單萜[4]、三萜皂苷[5]、黃酮[5,6]、咖啡酰基奎寧酸衍生物[6]、木脂素[7,8]、甾體化合物[5,7]、苯丙素類[7]、二萜[8]、脂肪酸及其他化合物[9-11]。同時，我們對這些從中藥糙葉五加中得到的單體化合物相關的抗神經(jīng)炎[4,7,11]、抗炎[9-12]、抗脂肪生成[13]、抗菌[14]、抗氧化和抗乙酰膽堿酯酶活性[6]也進行了相繼研究和報道。然而，到目前為止，對糙葉五加果實的研究多集中于乙酸乙酯部位[4,11]，而對其正丁醇萃取部位的物質(zhì)基礎研究鮮見報道，對于糙葉五加果實中極性較大的化學成分的研究與發(fā)現(xiàn)亟待進一步的關注。

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性細菌細胞壁外壁的組成成分，是由脂質(zhì)和多糖構(gòu)成的物質(zhì)(糖脂質(zhì))。當LPS作用于RAW264.7巨噬細胞上表達的Toll樣受體時，會導致各種炎癥信號通路被激活。這些被激活的巨噬細胞常常會產(chǎn)生并釋放大量的促炎介質(zhì)和細胞因子，如一氧化氮(NO)、前列腺素E2(PGE2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(ILs)等[12]。在前期的研究基礎之上[11]，為了進一步闡明中藥糙葉五加果實的抗炎藥效物質(zhì)基礎，深入挖掘其極性較大的成分的潛力，以期拓展該植物資源的藥用部位，我們首次基于LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞模型對糙葉五加果實的正丁醇萃取部位進行抗炎活性成分研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

NMR波譜(1D和2D)測試采用JEOL JNM ECP-400核磁共振儀(日本，東京)；HMQC和HMBC實驗參數(shù)設置分別為1JCH=140 Hz和nJCH=8 Hz；ESI-MS測試采用Q-TOF micro LC-MS/MS質(zhì)譜儀(美國，Waters)；高相液相色譜儀為YL9100 HPLC系統(tǒng)(韓國，英麟)；正相和反相TLC采用Kieselgel 60 F254和RP-18 F254s(德國，默克)；常規(guī)柱色譜硅膠(Kieselgel 60，70～230目和230～400目，默克)；反相柱色譜材料YMC-C18(德國，默克)；Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco BRL Co.(Grand Island，NY，USA)；脂多糖(LPS)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、Griess試劑購自美國Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO)；陽性對照紫鉚因(butein)來自于韓國圓光大學藥學院生藥及天然產(chǎn)物研究室(HPLC純度≥98.5%)。

本實驗樣品于2015年10月份采自湖南省新化，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學藥學院劉向前教授鑒定為五加科五加屬植物糙葉五加Acanthopanaxhenryi(Oliv.) Harms的果實，標本保存于湖南省重點實驗室中藥新藥研究與開發(fā)實驗室，標本號為AHF201510。

1.2 提取與分離

陰干后的糙葉五加果實(5 kg)，粉碎至粗粉，用甲醇回流提取3次后合并提取液(3 × 20 L)，減壓回收溶劑得總浸膏?？偨嗉尤脒m量蒸餾水分散后依次用石油醚(60～90)、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別回收溶劑，得石油醚萃取部分(40 g)、乙酸乙酯萃取部分(20 g)、正丁醇萃取部分(100 g)。所得正丁醇部位經(jīng)RP-C18柱色譜分離，以甲醇-水(1∶9→1∶0，V/V)為梯度洗脫溶劑系統(tǒng)，得到12個組份Fr.B1～Fr.B12。組份Fr.B5(5.6 g)經(jīng)正相硅膠柱色譜，三氯甲烷-甲醇-水(4∶1∶0.1→1∶1∶0.2，V/V/V)梯度洗脫后得亞組份Fr.B5.1～Fr.B5.8。亞組份Fr.B5.2(104 mg)用正相硅膠柱色譜純化，以三氯甲烷-甲醇-水(3∶1∶0.1→2∶1∶0.1，V/V/V)梯度洗脫，得化合物1(20 mg)和化合物2(30 mg)；亞組份Fr.B5.4(696 mg)用正相硅膠柱色譜分離純化，以三氯甲烷-甲醇-水(洗脫梯度為4∶1∶0.1→3∶1∶0.1，V/V/V)為流動相，得化合物4(54 mg)和化合物6(15 mg)；亞組份Fr.B5.5(145 mg)先用正相硅膠柱色譜分離，以三氯甲烷-甲醇-水(3∶1∶0.1，V/V/V)為流動相，再用RP-HPLC(乙腈-水=1∶4→3∶7，V/V)進行制備，得化合物5(3.5 mg，tR=24.8 min)、7(2.5 mg，tR=28.1 min)、8(2.8 mg，tR=30.1 min)、9(2.7 mg，tR=31.0 min)；類似地，亞組份Fr.B5.4.2(99 mg)先用正相硅膠柱色譜分離，以三氯甲烷-甲醇(15∶1→10∶1，V/V)為流動相，再用C18-HPLC(乙腈-水-0.1%甲酸=1∶4→1∶3，V/V)進行制備純化，得化合物12(3.2 mg，tR=15.2 min)；亞組份Fr.B5.6.1(50 mg)進一步用制備型HPLC(乙腈-水-0.1%甲酸=1∶4→1∶3，V/V)進行純化得化合物14(4.3 mg，tR=12.7 min)。組份Fr.B6(2.38 g)經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，三氯甲烷-甲醇(1∶1，V/V)為流動相，得亞組份Fr.B6.1～B6.5；亞組份Fr.B6.2(1.24 g)經(jīng)正相硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇(10∶1→6∶1，V/V)梯度洗脫后得亞組份Fr.B6.2.1～B6.2.7；Fr.B6.2.4(30 mg)經(jīng)正相HPLC(正己烷-乙醇=4∶1→3∶2，V/V)制備純化后得化合物11(2.0 mg，tR=27.0 min)、15(5.0 mg，tR=27.5 min)、16(4.4 mg，tR=22.0 min)、17(1.9 mg，tR=23.7 min)。亞組份Fr.B6.3(184 mg)由硅膠柱色譜分離純化，二氯甲烷-甲醇(15∶1，V/V)為洗脫劑，得到化合物10(8.6 mg)。組份Fr.B7(5.76 g)先經(jīng)凝膠Sephadex LH-20(三氯甲烷-甲醇=1∶1，V/V)柱色譜分離，然后再經(jīng)硅膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇=10∶1→1∶1，V/V)純化，最后用正相HPLC(正己烷-乙醇=4∶1→3∶2，V/V)制備得化合物13(2.3 mg，tR=25.0 min)。亞組份Fr.B7.2.8經(jīng)甲醇反復重結(jié)晶和脫色處理后得黃色粉末3(15 mg)。

1.3 MTT法細胞毒性試驗

取對數(shù)生長期RAW264.7巨噬細胞接種于96孔板中(1×105個細胞/孔)，37 ℃、5% CO2條件下溫孵培養(yǎng)12 h后，給藥組分別加入不同濃度的待測樣品(終濃度分別為20、40、80 μM)，同時每種藥物均設加入或不加入LPS(1 μg/mL)兩組。溶劑對照組均不加入受試藥物及LPS，但加入體積分數(shù)為0.1%的DMSO。繼續(xù)溫孵培養(yǎng)48 h后，每孔取出100 μL上清液，加入終質(zhì)量濃度為100 mg/mL的MTT工作液孵育0.5 h。形成的甲臜鹽使用酸化異丙醇溶解，在酶標儀(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)540 nm處測定各孔吸光度(A)值，以正常組細胞(未處理)的A值所對應的細胞存活率為100%，計算細胞存活率。每組重復3次獨立實驗。

1.4 NO抑制試驗

采用Griess法[28]檢測對LPS刺激下的RAW264.7細胞分泌NO的抑制作用。取對數(shù)生長期RAW264.7細胞接種于96孔板中(1×105個細胞/孔)，37 ℃、5% CO2條件下溫孵培養(yǎng)12 h后加入100 μL不同濃度的待測樣品(終濃度分別為20、40、80 μM)，溫孵培養(yǎng)0.5 h后加入100 μL的LPS(1 μg/mL)，同時設模型組(LPS+培養(yǎng)液)、陽性對照組(紫鉚因+LPS+培養(yǎng)液)、空白對照組(培養(yǎng)液)，繼續(xù)溫孵培養(yǎng)24 h。每組重復3次獨立實驗。將上清液(100 mL)與等體積的格氏試劑混合，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定混合物在540 nm處的A值，計算NO抑制率。

2 實驗結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1黃色粉末(甲醇)；EI-MS：m/z464[M]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.71(1H，d，J=2.0 Hz，H-2′)，7.56(1H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-6′)，6.85(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.32(1H，d，J=1.6 Hz，H-8)，6.14(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，5.23(1H，d，J=7.6 Hz，Glc-H-1′′)，3.86～3.23(6H，m，H-2′′～6′′)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：157.0(C-2)，134.4(C-3)，178.0(C-4)，161.6(C-5)，98.6(C-6)，164.6(C-7)，93.5(C-8)，157.7(C-9)，104.3(C-10)，121.7(C-1′)，114.7(C-2′)，144.5(C-3′)，148.5(C-4′)，116.3(C-5′)，121.9(C-6′)，103.2(Glc-C-1′′)，74.4(C-2′′)，76.8(C-3′′)，69.9(C-4′′)，77.0(C-5′′)，61.2(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道一致，故鑒定化合物1為槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物2黃色粉末(甲醇)；EI-MS：m/z464[M]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.84(1H，d，J=2.4 Hz，H-2′)，7.55(1H，dd，J=8.4，2.4 Hz，H-6′)，6.84(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.32(1H，d，J=1.6 Hz，H-8)，6.14(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，5.14(1H，d，J=7.6 Hz，Gal-H-1′′)，3.86～3.23(6H，m，H-2′′～6′′)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：157.0(C-2)，134.5(C-3)，178.0(C-4)，161.5(C-5)，98.6(C-6)，164.6(C-7)，93.5(C-8)，157.4(C-9)，103.2(C-10)，121.5(C-1′)，114.8(C-2′)，144.4(C-3′)，148.6(C-4′)，116.6(C-5′)，121.7(C-6′)，104.2(Gal-C-1′′)，71.9(C-2′′)，73.8(C-3′′)，68.7(C-4′′)，75.8(C-5′′)，60.7(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道一致，故鑒定化合物2為槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷。

化合物3黃色粉末(甲醇)；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.66(1H，d，J=2.0 Hz，H-2′)，7.61(1H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-6′)，6.85(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.38(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，6.19(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，5.10(1H，d，J=7.6 Hz，Glc-H-1′′)，4.51(1H，d，J=1.6 Hz，Rha-H-1′′′)，3.81(1H，dd，J=11.0，1.2 Hz，H-6′′a)，3.63(1H，m，H-6′′b)，3.55～3.24(8H，m，Glc-H-2′′～5′′，Rha-H-2′′′～5′′′)，1.12(3H，d，J=6.0 Hz，H-6′′′，Rha-CH3)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：157.2(C-2)，134.3(C-3)，178.1(C-4)，161.6(C-5)，98.7(C-6)，164.8(C-7)，93.6(C-8)，158.0(C-9)，104.3(C-10)，121.8(C-1′)，114.7(C-2′)，144.5(C-3′)，148.5(C-4′)，116.4(C-5′)，122.2(C-6′)，103.4(Glc-C-1′′)，74.4(C-2′′)，75.9(C-3′′)，70.1(C-4′′)，76.9(C-5′′)，67.2(C-6′′)，101.1(Rha-C-1′′′)，70.8(C-2′′′)，70.9(C-3′′′)，72.6(C-4′′′)，68.4(C-5′′′)，16.6(C-6′′′，Rha-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道一致，故鑒定化合物3為蘆丁。

化合物4黃色無定型粉末(甲醇)；EI-MS：m/z516[M]+；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.49(1H，d，J=15.6 Hz，H-7′′)，7.40(1H，d，J=15.6 Hz，H-7′)，7.05(1H，br s，H-2′′)，7.01(1H，br s，H-2′)，6.94(1H，d，J=8.0 Hz，H-6′′)，6.90(1H，d，J=8.0 Hz，H-6′)，6.74(2H，br s，H-5′′，H-5′)，6.25(1H，d，J=15.6 Hz，H-8′′)，6.18(1H，d，J=16.0 Hz，H-8′)，5.28(1H，br s，H-3)，4.01(1H，br s，H-5)，3.54(1H，d，J=8.4 Hz，H-4)，2.58(1H，m，H-6a)，2.38(1H，m，H-2a)，2.19(1H，m，H-6b)，1.81(1H，m，H-2b)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：175.8(C-7)，166.9(C-9′′)，165.6(C-9′)，149.9(C-4′′)，149.1(C-4′)，146.6(C-3′′)，146.5(C-3′)，145.5(C-7′′)，144.3(C-7′)，126.1(C-1′′)，125.6(C-1′)，121.9(C-6′′)，121.2(C-6′)，116.5(C-5′′)，116.5(C-5′)，115.3(C-2′′)，115.2(C-2′)，116.5(C-8′)，114.7(C-8′′)，82.4(C-1)，73.2(C-4)，70.9(C-3)，69.6(C-5)，38.3(C-2)，35.3(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17,18]報道一致，故鑒定化合物4為1，3-雙咖啡酰奎寧酸。

化合物5黃色無定型粉末(甲醇)；EI-MS：m/z516[M]+；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.50(2H，d，J=15.6 Hz，H-7′，7′′)，7.02(2H，m，H-2′，2′′)，6.95(2H，m，H-6′，6′′)，6.75(2H，m，H-5′，H-5′′)，6.24(2H，d，J=15.6 Hz，H-8′，8′′)，5.55(1H，br s，H-3)，4.98(1H，br s，H-4)，4.24(1H，br s，H-5)，2.15(3H，m，H-6a，6b，2a)，1.87(1H，br s，H-2b)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：177.6(C-7)，166.8(C-9′′)，166.6(C-9′)，149.2(C-4′′)，149.2(C-4′)，146.2(C-3′′)，146.2(C-3′)，146.1(C-7′′)，146.1(C-7′)，126.1(C-1′′)，125.8(C-1′)，122.0(C-6′′)，122.0(C-6′)，116.4(C-5′′)，116.4(C-5′)，115.4(C-2′′)，115.4(C-2′)，114.2(C-8′′)，114.2(C-8′)，76.8(C-1)，76.1(C-4)，68.4(C-3)，69.1(C-5)，40.2(C-2)，38.3(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17,19]報道一致，故鑒定化合物5為1，4-雙咖啡?？鼘幩?。

化合物6黃色無定型粉末(甲醇)；EI-MS：m/z516[M]+；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.50(1H，d，J=16.0 Hz，H-7′′)，7.38(1H，d，J=16.0 Hz，H-7′)，7.03(2H，br s，H-2′，2′′)，6.94(2H，t，J=8.0 Hz，H-6′，6′′)，6.73(2H，t，J=8.0 Hz，H-5′，H-5′′)，6.23(1H，d，J=16.0 Hz，H-8′′)，6.20(1H，d，J=16.4 Hz，H-8′)，5.18(1H，d，J=10.8 Hz，H-5)，3.68(1H，br s，H-3)，3.65(1H，br s，H-4)，2.25(1H，t，J=12.0 Hz，H-6a)，1.98(3H，m，H-2a，2b，6b)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：174.2(C-7)，166.4(C-9′′)，165.7(C-9′)，148.9(C-4′′)，148.6(C-4′)，146.3(C-3′′)，146.2(C-3′)，145.3(C-7′′)，144.3(C-7′)，126.3(C-1′′)，126.1(C-1′)，121.6(C-6′′)，121.0(C-6′)，116.3(C-5′′)，116.3(C-5′)，115.5(C-2′′)，115.4(C-2′)，115.1(C-8′′)，116.2(C-8′)，83.1(C-1)，71.4(C-4)，69.3(C-3)，70.1(C-5)，40.0(C-2)，34.0(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17,18]報道一致，故鑒定化合物6為1，5-雙咖啡?？鼘幩帷?/p>

化合物7黃色無定型粉末(甲醇)；EI-MS：m/z516[M]+；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.45(1H，d，J=16.0 Hz，H-7′)，7.42(1H，d，J=16.0 Hz，H-7′′)，7.01(2H，br s，H-2′，2′′)，6.94(2H，dd，J=8.0，1.6 Hz，H-6′，6′′)，6.74(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，6.72(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′′)，6.21(1H，d，J=16.0 Hz，H-8′)，6.16(1H，d，J=16.0 Hz，H-8′′)，5.52(1H，m，H-3)，4.88(1H，m，H-4)，4.15(1H，br s，H-5)，2.11-1.71(4H，m，H2-2，H2-6)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：177.5(C-7)，168.0(C-9′)，168.0(C-9′′)，150.1(C-4′)，150.1(C-4′′，147.2(C-3′)，147.2(C-3′′)，147.3(C-7′)，147.2(C-7′′)，127.2(C-1′)，127.2(C-1′′)，123.4(C-6′)，123.4(C-6′′)，117.5(C-5′)，117.5(C-5′′)，116.3(C-2′)，116.3(C-2′′)，115.6(C-8′)，115.6(C-8′′)，77.7(C-1)，77.0(C-4)，70.5(C-5)，70.1(C-3)，40.6(C-2)，39.5(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18,20]報道一致，故鑒定化合物7為3，4-雙咖啡?？鼘幩帷?/p>

化合物8黃色無定型粉末(甲醇)；EI-MS：m/z516[M]+；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.50(1H，d，J=16.0 Hz，H-7′′)，7.46(1H，d，J=16.0 Hz，H-7′)，7.10(1H，d，J=1.6 Hz，H-2′′)，7.08(1H，d，J=1.6 Hz，H-2′)，7.02(2H，dd，J=8.0，1.6 Hz，H-6′，6′′)，6.83(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′′)，6.80(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，6.29(1H，d，J=16.0 Hz，H-8′′)，6.20(1H，d，J=16.0 Hz，H-8′)，5.22(1H，m，H-3)，5.15(1H，br s，H-5)，3.85(1H，m，H-4)，2.20～1.97(4H，m，H2-2，H2-6)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：175.5(C-7)，166.6(C-9′′)，166.0(C-9′)，148.4(C-4′′)，148.3(C-4′)，145.6(C-3′′)，145.2(C-3′)，145.7(C-7′′)，145.7(C-7′)，125.9(C-1′′)，125.8(C-1′)，122.0(C-6′′)，121.8(C-6′)，116.2(C-5′′)，116.1(C-5′)，114.8(C-2′′)，114.5(C-2′)，115.1(C-8′′)，115.0(C-8′)，72.8(C-1)，71.2(C-3)，71.2(C-5)，71.0(C-4)，36.1(C-2)，35.0(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18,20]報道一致，故鑒定化合物8為3，5-雙咖啡?？鼘幩帷?/p>

化合物9黃色無定型粉末(甲醇)；EI-MS：m/z516[M]+；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.50(1H，d，J=16.0 Hz，H-7′′)，7.40(1H，d，J=16.0 Hz，H-7′)，7.03(2H，br s，H-2′，2′′)，6.94(2H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-6′，6′′)，6.73(2H，d，J=8.0 Hz，H-5′，H-5′′)，6.23(1H，d，J=16.0 Hz，H-8′′)，6.20(1H，d，J=16.0 Hz，H-8′)，5.40(1H，m，H-5)，4.91(1H，m，H-4)，4.07(1H，m，H-3)，2.20-1.90(4H，m，H2-2，H2-6)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：175.5(C-7)，165.7(C-9′)，165.6(C-9′′)，148.3(C-4′)，148.2(C-4′′)，145.2(C-3′)，145.0(C-3′′)，145.3(C-7′)，145.3(C-7′′)，125.3(C-1′)，125.2(C-1′′)，121.3(C-6′)，121.2(C-6′′)，115.4(C-5′)，115.4(C-5′′)，114.4(C-2′)，114.5(C-2′′)，114.0(C-8′)，114.1(C-8′′)，73.2(C-1)，72.4(C-4)，68.0(C-3)，64.0(C-5)，39.7(C-6)，35.4(C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18,20]報道一致，故鑒定化合物9為4，5-雙咖啡?？鼘幩?。

化合物10黃色粉末(甲醇)；EI-MS：m/z368[M]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.54(1H，d，J=16.0 Hz，H-7′)，7.03(1H，d，J=2.0 Hz，H-2′)，6.95(1H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-6′)，6.78(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，6.23(1H，d，J=16.0 Hz，H-8′)，5.29(1H，m，H-3)，4.14(1H，m，H-5)，3.74(1H，dd，J=7.6，3.2 Hz，H-4)，3.68(3H，s，7-OCH3)，2.23(3H，m，H-2a，6a，6b)，2.02(1H，m，H-2b)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：74.5(C-1)，36.7(C-2)，69.0(C-3)，70.8(C-4)，71.2(C-5)，36.4(C-6)，174.1(C-7)，126.3(C-1′)，113.7(C-2′)，145.5(C-3′)，148.4(C-4′)，115.2(C-5′)，121.6(C-6′)，145.9(C-7′)，113.8(C-8′)，166.9(C-9′)，51.6(C-7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[21]報道一致，故鑒定化合物10為綠原酸甲酯。

2.2 MTT法細胞毒性試驗結(jié)果

MTT法細胞毒性試驗結(jié)果表明，在0～80 μM的濃度范圍內(nèi)，被測試化合物(1～17)均無明顯的細胞毒性(見圖2)。

圖2 用化合物1～17處理后的RAW264.7巨噬細胞的細胞存活率

2.3 NO抑制試驗結(jié)果

NO抑制試驗結(jié)果表明，化合物10和16具有較好的NO抑制活性且呈劑量相關，當測試濃度達到80 μM時，其NO抑制率分別為53.3%和55.6%；化合物6和17則表現(xiàn)出了適度的NO抑制活性且抑制率分別為40.1%和41.3%；其它被測試化合物表現(xiàn)出微弱或者無NO抑制效果(NO抑制率< 40%)，結(jié)果見圖3。另外，對于這些單體化合物的潛在抗炎活性需要進一步的研究來評估。

圖3 化合物1～17對LPS刺激的RAW264.7巨噬細胞產(chǎn)生NO的影響。

3 討論

本實驗首次以脂多糖(LPS)誘導的巨噬細胞RAW264.7為生物活性篩選模型對糙葉五加果實正丁醇萃取部位進行抗炎藥效物質(zhì)基礎研究，從中分離鑒定出17個化合物，包括3個黃酮苷類、7個咖啡酰基奎寧酸類、7個單萜苷類(見圖1)。我們前期對糙葉五加的根及根皮進行了相關研究并報道了22個化合物，包括9個木脂素、4個咖啡酰基奎寧酸、3個酚酸類、2個甾體類、1個二萜、1個香豆素、1個長鏈脂肪酸、1個生物堿[7,8]，其主要成分為木脂素、咖啡?；鼘幩?、酚酸類及甾體類。為了進一步拓展糙葉五加資源的藥用部位，探究其果實部位是否可以替代其傳統(tǒng)的藥用部位(根)入藥，結(jié)合我們的前期研究基礎，從糙葉五加果實乙酸乙酯萃取部位分離鑒定了18個單體化合物，包括5個木脂素、4個單萜、2個黃酮苷、1個酚酸、1個香豆素、1個苯丙素苷、1個糠醛、1個麥芽酚類、1個苯甲苷和1個三萜苷，其主要成分類型為木脂素和單萜類[11]；從中我們發(fā)現(xiàn)糙葉五加果實的主要藥效物質(zhì)基礎為黃酮類、咖啡?；鼘幩犷?、單萜類及木脂素類。比較果實和根的化學成分初步發(fā)現(xiàn)，它們的物質(zhì)基礎存在一定的差異，說明各部位有不同的用途，因此，在使用上應該加以區(qū)分。本文進一步豐富了中國特產(chǎn)植物糙葉五加的化學內(nèi)涵，為以后對該植物的進一步研究提供一定的科學依據(jù)和理論參考。

圖1 化合物1～17的化學結(jié)構(gòu)