張宏亮，蔣 霞，黃天敏，丘 岳，黃光明，黃仁彬，黃振光

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，南寧 530021

糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，亦是發(fā)達(dá)國家和地區(qū)終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的首要原因[1]。目前對于DKD，尚缺乏特異性的治療藥物。臨床上主要通過控制血糖、血壓、血脂、尿酸以及使用腎素-血管緊張素系統(tǒng)抑制劑、改善腎臟微循環(huán)藥物等延緩DKD進(jìn)展[2]。

中草藥由于其多組分、多途徑、多靶點的優(yōu)勢，在復(fù)雜疾病的防治方面顯示了良好的效果。我們前期開展了若干抗DKD中草藥及其活性成分的研究，發(fā)現(xiàn)酢漿草科屬植物楊桃根(the root ofAverrhoacarambolaL.，RAC)在防治DKD方面顯示了良好的優(yōu)勢[3]，但作用機制不明。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于整體性與系統(tǒng)性的一種研究方法，將藥物-靶點與生物信息網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合，類似于中醫(yī)提出的整體、辨證的觀點[4]?；诖?，我們將采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建楊桃根主要成分與DKD共有靶點，探討楊桃根防治DKD的潛在作用機制。

1 研究方法

1.1 楊桃根有效成分篩選

根據(jù)我們課題組前期關(guān)于楊桃根物質(zhì)基礎(chǔ)的研究結(jié)果[5,6]，結(jié)合查詢關(guān)于楊桃根成分的文獻(xiàn)，建立成分庫。通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/)和Chemspider數(shù)據(jù)庫(http://www.chemspider.com/Default.aspx)，查詢已鑒定的成分的Canonical SMILES 字符串。

1.2 靶點篩選

楊桃根成分的靶點預(yù)測采用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫( http://www.swisstargetprediction.ch/)。該數(shù)據(jù)庫通過2D和3D結(jié)構(gòu)相似性的特點，間接預(yù)測化合物的作用靶點[7]。具體操作為，將上一步查詢到的Canonical SMILES字符串輸入Swiss TargetPrediction網(wǎng)站，從而獲得每一成分的潛在靶點。

DKD疾病靶點預(yù)測采用GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)。分別以“Diabetic Kidney Disease”，“Diabetic nephropathy”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，以相關(guān)性分?jǐn)?shù)(Relevance score≥30)作為篩選條件，從而得到DKD相關(guān)靶點。

進(jìn)一步，利用網(wǎng)絡(luò)平臺繪制韋恩圖(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，獲得楊桃根主要成分與DKD的共有基因靶點信息，即得到楊桃根防治DKD的潛在作用靶點。

1.3 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

參考目前發(fā)表的文獻(xiàn)，用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建活性成分-靶點的可視化網(wǎng)絡(luò)，然后對該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治霁@得各節(jié)點的中心度值(degree)[8]。

1.4 靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點篩選

利用String11.0在線數(shù)據(jù)庫對靶點蛋白相互作用(protein protein interaction,PPI)進(jìn)行分析。具體操作為，將靶點輸入String，物種選擇“Homo sapiens”，以得分>0.4作為篩選條件，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

進(jìn)一步，將PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件，利用Cytoscape的CytoHubba插件篩選hub gene。

1.5 GO和KEGG通路富集分析

利用WebGestalt在線數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵靶點進(jìn)行GO和KEGG分析，以P≤0.05為臨界，獲取GO及KEGG信號通路結(jié)果。

1.6 動物實驗驗證

1.6.1 實驗動物

SPF級KM雄性小鼠60只，體重20±2 g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號SCXK(桂)2015-0001。小鼠飼養(yǎng)條件為：溫度25±2 ℃，相對濕度50%±20%，光照/黑暗交替12/12h，且自由進(jìn)食、飲水。

1.6.2 楊桃根有效成分提取

楊桃根藥材粉碎，加8倍量60%乙醇-水浸泡30 min，常壓下加熱回流提取3次，每次1 h，濾過合并提取液；減壓回收乙醇，即得楊桃根提取物。

1.6.3 動物建模及給藥干預(yù)

所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機地分為兩組，空白對照組及模型組?？瞻讓φ战M給予水和普通飼料，模型組給予高糖高脂飼料。高糖高脂飼料配方見本課題組以前發(fā)表的文獻(xiàn)[3]。連續(xù)喂養(yǎng)4周后，禁食過夜，單次腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)110 mg/kg；當(dāng)血糖維持在11.2～16.7 mmol/L時即為造模成功。

除10只空白對照組小鼠外，其余50只小鼠隨機分為5組(模型組，陽性對照組，楊桃根高、中、低劑量組)，每組各10只。

楊桃根提取物高、中、低劑量組(RAC-H、RAC-M、RAC-L)分別給予1.2、0.6、0.3 g/kg/d灌胃，并同時給予高糖高脂飼料。陽性對照組(GQ)給予格列喹酮溶液灌胃(10 mg/kg/d并同時給予高糖高脂飼料。模型組(DM)僅給予高糖高脂飼料，空白對照組(NC)僅給予蒸餾水灌胃。

1.6.4 樣品的采集和處理

連續(xù)干預(yù)4周后，小鼠隔夜禁食12 h，測量空腹血糖，取血檢測相關(guān)指標(biāo)，并用Western blot法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)。

1.6.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 活性成分篩選

根據(jù)我們課題組前期關(guān)于楊桃根物質(zhì)基礎(chǔ)的研究結(jié)果，結(jié)合查詢關(guān)于楊桃根成分的文獻(xiàn)，目前楊桃根的主要成分有24個，根據(jù)結(jié)構(gòu)信息查詢得到所有成分的Canonical SMILES字符串，結(jié)果見表1。

表1 楊桃根主要活性成分及Canonical SMILES字符串

續(xù)表1(Continued Tab.1)

2.2 活性成分治療疾病相關(guān)靶點的篩選

根據(jù)Swiss Target Prediction 網(wǎng)站對24個活性成份進(jìn)行靶基因預(yù)測，共得到2 331個相關(guān)靶點，進(jìn)一步排除重復(fù)靶點，共得到潛在靶點281個。整理“成分-靶點”對，然后導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0，建立“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，如圖1。由圖可知，該網(wǎng)絡(luò)共有663條邊，305個節(jié)點。305個節(jié)點中，24個紅色節(jié)點代表楊桃根的每一個成分，281個藍(lán)色節(jié)點代表與成分對應(yīng)的靶點，即潛在相關(guān)靶點。

圖1 成分-潛在相關(guān)靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 DKD靶點預(yù)測結(jié)果

從Genecards數(shù)據(jù)庫中篩選得到14 329個DKD相關(guān)靶點，去除重復(fù)后得到662個潛在靶點。然后根據(jù)281個成分靶點與662個疾病靶點繪制韋恩圖(見圖2)，從而獲得DKD共性靶點基因59個。

圖2 楊桃根提取物成分與DKD靶點韋恩圖

2.4 疾病靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將DKD共性靶點基因?qū)隨TRING在線數(shù)據(jù)庫，查詢59個共性靶點的相互作用關(guān)系，進(jìn)行可視化分析后獲得疾病靶蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)(圖3)，其節(jié)點數(shù)為59，邊數(shù)為461，平均節(jié)點度為15.6。

圖3 楊桃根防治DKD潛在靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 關(guān)鍵靶點的篩選

將PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件中，利用CytoHubba插件中的MCC算法篩選最重要的10個關(guān)鍵基因(圖4)。這些關(guān)鍵基因包括：基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、表皮生長因子受體(EGFR)、成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF2)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)、絲裂原激活的蛋白激酶1(MAPK1)、基質(zhì)金屬肽酶2(MMP2)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、半胱天冬酶3(CASP3)、原癌基因Hras(HRAS)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。

圖4 CytoHubba篩選關(guān)鍵靶點的網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 活性成分-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)分析

根據(jù)篩選得到的活性成分和10個關(guān)鍵靶點，利用Cytoscape軟件構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，見圖5所示。由圖可知，該網(wǎng)絡(luò)共有節(jié)點24個，邊32條，其中14個節(jié)點代表楊桃根成分，用紅色標(biāo)示，10個節(jié)點代表潛在關(guān)鍵靶點，用藍(lán)色標(biāo)示。

圖5 楊桃根防治DKD活性成分-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 靶點的 GO 生物功能注釋

GO富集分析主要包括生物過程(biological process，BP)、細(xì)胞組成(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)三部分。利用WebGestalt對10個關(guān)鍵靶基點進(jìn)行GO生物功能注釋，并分別對前10個條目進(jìn)行可視化分析，見圖6。圖中橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)，縱坐標(biāo)表示富集條目。

圖6 楊桃根防治DKD關(guān)鍵靶點GO富集柱狀圖

在生物過程(BP)中，主要富集條目為：調(diào)控細(xì)胞遷移(positive regulation of cell migration)、調(diào)控細(xì)胞運動(positive regulation of cell motility)、調(diào)控細(xì)胞成分的運動(positive regulation of cellular component movement)、運動調(diào)控(positive regulation of locomotion)、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路(transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway)、酶聯(lián)受體蛋白信號通路(enzyme linked receptor protein signaling pathway)、細(xì)胞增殖調(diào)控(positive regulation of cell proliferation)等。

在細(xì)胞組成(CC)中，富集條目主要分布于：富含纖維膠凝蛋白的顆粒內(nèi)腔(ficolin-1-rich granule lumen)、膜筏(membrane raft)、膜微區(qū)(membrane microdomain)、膜區(qū)(membrane region)、囊泡腔(vesicle lumen)等。

在分子功能(MF))中，富集條目主要分布于：趨化活性(chemoattractant activity)、磷脂酰肌醇-4,5-雙磷酸3-激酶活性(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase activity)、磷脂酰肌醇二磷酸激酶活性(phosphatidylinosital bisphosphate kinase activity)、磷脂酰肌醇3-激酶活性(phosphatidylinasitol 3-kinase activity)、金屬內(nèi)肽酶活性(metalloendopeptidase activity)、磷酸酶結(jié)合(phasphatase binding)、細(xì)胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、內(nèi)肽酶活性(endopeptidase actirity)等。

2.8 KEGG通路富集分析

利用WebGestalt在線數(shù)據(jù)庫對10個關(guān)鍵靶基點進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果進(jìn)行可視化分析，得到KEGG富集分析柱狀圖(見表2)。由表可知，關(guān)鍵靶點主要富集通路如下：蛋白聚糖與腫瘤(proteoglycans in cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、腫瘤相關(guān)microRNA(microRNAs in cancer)、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、癌癥通路(pathways in cancer)、糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、松弛素信號通路(relaxin signaling pathway)、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染(kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、內(nèi)分泌抵抗(endocrine resistance)、缺氧誘導(dǎo)因子信號通路(HIF-1 signaling pathway)。

表2 楊桃根防治DKD關(guān)鍵靶點的KEGG富集分析圖

續(xù)表2(Continued Tab.2)

2.9 動物實驗驗證結(jié)果

2.9.1 小鼠腎功能變化

胱抑素C(CysC)作為一種敏感性好、特異性高的標(biāo)志物，可以在腎損傷早期做出準(zhǔn)確的預(yù)測。在本研究中，模型組的CysC水平均明顯增加(P<0.05)；當(dāng)給予不同劑量的楊桃根提取物干預(yù)后，各組的CysC水平均明顯下降，且呈劑量依賴性(P<0.05)。尤其是中、高劑量的DMDD，結(jié)果見圖7。

圖7 楊桃根對糖尿病小鼠腎功能的影響

2.9.2 Western blot檢測結(jié)果

Western blot結(jié)果如圖9所示，模型組的TGFβ1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；當(dāng)給予楊桃根提取物預(yù)后，其表達(dá)水平均下調(diào)，且有劑量依賴趨勢。而TGFβ1與AGE-RAGE信號通路相關(guān)，提示AGE-RAGE信號通路在楊桃根提取物防治DKD的過程中發(fā)揮重要作用。

3 討論

DKD患病率高，心腦血管并發(fā)癥風(fēng)險大，是糖尿病患者死亡的重要風(fēng)險因素[9]。然而，由于DKD發(fā)生機制復(fù)雜，目前關(guān)于DKD的治療尚未取得突破性進(jìn)展[10]。關(guān)于楊桃根治療DKD，我們課題組前期進(jìn)行了大量的研究。發(fā)現(xiàn)楊桃根及其主要成分改善糖尿病及腎損害相關(guān)并發(fā)癥可能與調(diào)節(jié)糖代謝和脂代謝紊亂、胰島素抵抗以及氧化應(yīng)激等有關(guān)[11]。

圖8 小鼠腎組織TGFβ1蛋白表達(dá)水平

進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，其發(fā)生機制可能與TLR4/NF-κB、TGFβ/Smad2/3等多條信號通路相關(guān)[12]。然而，具體的作用機制尚待進(jìn)一步闡明。

中藥具有成分復(fù)雜，藥理作用廣泛的特點。楊桃根發(fā)揮防治DKD作用，取決于哪些活性成分以及其對應(yīng)的靶點是什么是我們關(guān)注的重點。我們課題組前期對楊桃根的有效成分進(jìn)行了提取分離純化分析，共得到24個活性化合物。在這些化合物中，我們發(fā)現(xiàn)化合物2(楊桃根環(huán)己二酮)在DKD的防治過程中發(fā)揮了重要的作用，是潛在的主要活性成分[13]。然而其他成分是否在DKD的防治過程中發(fā)揮重要作用，還需進(jìn)一步研究。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選，我們發(fā)現(xiàn)，除了楊桃根環(huán)己二酮之外，苦瓜苷C、櫻桃素、胡蘿卜甾醇等成分亦與多個DKD關(guān)鍵靶點相關(guān)。提示我們，這些成分在DKD的防治過程也發(fā)揮了重要的作用，有待我們后續(xù)的進(jìn)一步驗證。

關(guān)鍵靶點篩選方面，我們篩選出了10個關(guān)鍵靶標(biāo)，分別為：基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、基質(zhì)金屬肽酶2(MMP2)、表皮生長因子受體(EGFR)、成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF2)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)、絲裂原激活的蛋白激酶1(MAPK1)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、半胱天冬酶3(CASP3)、原癌基因Hras(HRAS)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。在這10個關(guān)鍵靶標(biāo)中，MMP2和MMP9為基質(zhì)金屬蛋白酶的重要成員，作用底物主要為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的Ⅳ型膠原，其功能與降解和重構(gòu)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)動態(tài)平衡密切相關(guān)[14]。DKD患者早期有腎小球基底膜和腎小球系膜區(qū)ECM累積的臨床表現(xiàn)，MMP9和MMP2及其組織抑制因子(TIMPs)在ECM降解過程中發(fā)揮非常重要的作用[15]。此外，MMP9結(jié)合CD44可釋放儲存的TGF-β1[16]，MMP9亦可通過釋放血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)以參與血管生成[17]。

KEGG富集分析顯示關(guān)鍵靶點主要富集于蛋白聚糖與腫瘤、膀胱癌、腫瘤相關(guān)MicroRNA、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、癌癥通路、糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號通路、松弛素(屬于胰島素家族)信號通路、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、內(nèi)分泌抵抗、缺氧誘導(dǎo)因子相關(guān)信號通路上。在這些信號通路中，AGE-RAGE信號通路、松弛素信號通路、內(nèi)分泌抵抗、缺氧誘導(dǎo)因子等均與糖尿病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)-糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGEs)信號通路是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。在DKD的發(fā)生和發(fā)展過程中，AGE-RAGE主要通過激活NF-κB，引起大量黏附分子、生長因子、促炎細(xì)胞因子等的表達(dá)和釋放，最終引起慢性細(xì)胞活化和組織損傷。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，楊桃根提取物DMDD可以通過抑制NF-κB的激活，從而減輕一系列的炎癥損傷來達(dá)到防治糖尿病的相關(guān)并發(fā)癥的作用[12]。AGE-RAGE還可刺激VEGF的表達(dá)，從而增加血管的通透性，導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生。另AGE-RAGE還可刺激TGF-β1的產(chǎn)生，誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化蛋白MCP-1表達(dá)的增強來引起DKD的發(fā)生和發(fā)展[18]。我們通過動物實驗驗證了該信號通路，TGFβ1和NF-κB在糖尿病模型組的蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，當(dāng)給予楊桃根提取物預(yù)后，它們的表達(dá)水平均下調(diào)，且有劑量依賴趨勢，提示AGE-RAGE信號通路在楊桃根提取物防治DKD的過程中發(fā)揮重要作用。

綜上，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，篩選出了楊桃根發(fā)揮藥理作用的的主要活性成分包括楊桃根環(huán)己二酮、苦瓜苷C、櫻桃素和胡蘿卜甾醇等。這些活性成分主要通過MMP9、MMP2、EGFR、FGF2、STAT3、MAPK1、VEGFA和CASP3等關(guān)鍵靶點，參與AGE-RAGE信號通路、Relaxin信號通路、胰島素抵抗信號通路和缺氧誘導(dǎo)因子信號通路發(fā)揮防治DKD的作用。通過本研究，初步闡明了楊桃根的主要藥效成分及其作用靶點和相關(guān)通路在DKD防治中的作用。這些研究不僅與我們課題組的前期研究相互驗證，還為更多后續(xù)的研究提供了思路和方向。