顧 婷，和 英，肖培云，楊永壽

大理大學藥學院，大理 671000

美洲大蠊(PeriplanetaamericanaL.)是蜚蠊屬中最大的昆蟲之一[1]。蜚蠊藥用價值在《神農本草經》和明代的《本草綱目》早有記載[2]。20世紀80年代以來，以李樹楠教授為主的科研人員致力于美洲大蠊的藥用研究，將人工飼養(yǎng)的美洲大蠊乙醇提取物內服或者外用，用于治療潰瘍、癌癥等[3]。研究發(fā)現，美洲大蠊的化學成分包括：蛋白質、氨基酸、肽類、糖類、脂肪酸、信息素及其他，有抗腫瘤、抗肝纖維化、抑菌、抗病毒、抗氧化等生物活性[4]。

糖類物質是地球上數量最多的有機化合物，占總生物量的3/4，而多糖類物質約占其中總量的90%[5]。多糖的生物活性主要包括抗腫瘤、降血糖、抗衰老、增強骨髓造血機能、調節(jié)免疫等，且基本無毒副作用，因而受到人們的廣泛關注，在醫(yī)藥領域極具應用前景[6]。其活性與其相對分子質量、化學組成、苷鍵構型、連接方式和空間構型有關[7]。為了解美洲大蠊多糖的特性，可以采用水解反應，分析單糖組成及含量的變化，為美洲大蠊多糖的質量控制提供依據。實驗以美洲大蠊多糖為實驗對象，在單因素實驗的基礎上，以高效液相色譜圖中單糖總峰面積為指標，利用響應面實驗，優(yōu)化美洲大蠊多糖的水解工藝以獲得單糖含量最高的工藝，此外，對美洲大蠊多糖的抗氧化活性進行了研究，為美洲大蠊多糖的結構鑒定和后續(xù)開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；TU-1901雙光束紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；AL240-IC型分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；HYQ-3110渦旋混勻器(美國精騏有限公司)。

1.2 材料

美洲大蠊藥材(云南省大理州彌渡縣美蠊養(yǎng)殖基地)經大理大學云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室楊自忠教授鑒定為昆蟲綱蜚蠊科昆蟲美洲大蠊PeriplanetaamericanaL.；葡萄糖(Glu，批號171206)、甘露糖(Man，批號170921)、半乳糖(Gal，批號171206)、鼠李糖(Rha，批號171024)、巖藻糖(Fuc，批號170831)、木糖(Xyl，批號170912)、鹽酸氨基葡萄糖(Gah，批號171210)、阿拉伯糖(Ara，批號171219)，均購于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，以上單糖純度均﹥98%。

2 實驗方法

2.1 美洲大蠊多糖提取

稱取500 g美洲大蠊藥材，料液比1∶10，60 ℃回流提取2次，2 h/次，4 000 rpm，離心15 min，取上清液，石油醚脫脂，60 ℃濃縮。加入4倍體積的95%乙醇溶液醇沉24 h，離心，取沉淀，加水溶解，加入1/4體積的Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)，震蕩10 min，離心，取水相，濃縮，冷凍干燥后即得美洲大蠊多糖。

2.2 PMP-HPLC衍生化法測定美洲大蠊多糖的單糖組成

2.2.1 美洲大蠊多糖水解液的配制

精密稱取美洲大蠊多糖20 mg，置安剖瓶中，1 mL蒸餾水溶解，加2 mol/L三氟乙酸(TFA)，充氮，熔封，置于烘箱中水解。將安剖瓶中水解液轉移至旋蒸瓶中，加少量甲醇洗滌安剖瓶，洗液轉移至旋蒸瓶中，50 ℃旋蒸至干，重復加甲醇，蒸干至無酸味。依次精加1、0.5、0.5 mL水超聲溶解樣品，并將其轉移至EP管中，離心即得美洲大蠊多糖水解液。

2.2.2 混合單糖對照品溶液的配制

精密稱取葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、巖藻糖、木糖、鹽酸氨基葡萄糖、阿拉伯糖各約1 mg分別置EP管中，精加1 mL水溶解，即得各單糖對照品溶液。移液槍吸取葡萄糖50 μL、甘露糖30 μL、半乳糖40 μL、鼠李糖20 μL、巖藻糖10 μL、木糖10 μL、鹽酸氨基葡萄糖30 μL、阿拉伯糖15 μL至EP管中即得混合單糖對照品溶液。

2.2.3 衍生化反應

精密吸取混合單糖對照品溶液100 μL和美洲大蠊多糖水解液200 μL，分別加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液與0.3 mol/L氫氧化鈉溶液各200 μL，混勻，70 ℃水浴反應100 min，冰浴冷卻，加250 μL 0.3 mol/L的鹽酸溶液，混勻。氯仿洗滌3次，每次2 mL，離心，取上清，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得單糖標準品及多糖PMP衍生物。

2.2.4 HPLC條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：35 ℃；流速：0.8 mL/min；檢測波長：250 nm；流動相：A：0.025 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.86)，B：乙腈。梯度洗脫條件(以B的比例記錄)：0～20 min，16.5→17%；20～35 min，17→22%；進樣量：10 μL。

2.3 單因素實驗(n=3)

2.3.1 TFA用量考察

精密稱取美洲大蠊多糖5份，20 mg/份，置安剖瓶中，1 mL蒸餾水溶解，分別加入2、3、4、5、6 mL TFA，充氮，熔封。置于烘箱中，110 ℃水解8 h，后將安剖瓶中水解液轉移至旋蒸瓶中，加少量甲醇洗滌安剖瓶，洗液轉移至旋蒸瓶中，50 ℃旋蒸至干，重復加甲醇，蒸干至無酸味。依次精加1、0.5、0.5 mL水超聲溶解樣品，并將其轉移至EP管中，精密吸取美洲大蠊多糖水解液200 μL，分別加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液與0.3 mol/L氫氧化鈉溶液各200 μL，混勻，70 ℃水浴反應100 min，冰浴冷卻，加250 μL 0.3 mol/L的鹽酸溶液，混勻。氯仿洗滌3次，每次2 mL，離心，取上清，0.45 μm微孔濾膜過濾，得多糖PMP衍生物，HPLC上機檢測，計算單糖總峰面積。

2.3.2 水解時間考察

精密稱取美洲大蠊粗多糖5份，20 mg/份，置安剖瓶中，1 mL蒸餾水溶解，加3 mL TFA，充氮，熔封。置于烘箱中，110 ℃分別水解0.5、1、1.5、2、4 h，然后將安剖瓶中水解液轉移至旋蒸瓶中，后續(xù)操作與“2.3.1”項下一致，HPLC上機檢測，計算單糖總峰面積。

2.3.3 水解溫度考察

精密稱取美洲大蠊粗多糖5份，20 mg/份，置安剖瓶中，1 mL蒸餾水溶解，加3 mL TFA，充氮，熔封。置于烘箱中，90、100、110、120、130 ℃水解1 h，然后將安剖瓶中水解液轉移至旋蒸瓶中，后續(xù)操作與“2.3.1”項下一致，HPLC上機檢測，計算單糖總峰面積。

2.4 響應面實驗優(yōu)化美洲大蠊的水解工藝

在單因素實驗基礎上，依據Design-Expert 8.0.6 Trial軟件，運用Box-Behnken中心組合實驗設計原理，以水解時間、水解溫度、TFA用量三個因子為自變量，以美洲大蠊多糖水解出來的單糖總峰面積為響應值，對美洲大蠊多糖的水解條件進行優(yōu)化，響應面實驗的因素及水平見表1。

表1 響應面實驗因素水平表

2.5 數據處理

使用統(tǒng)計軟件Design-Expert 8.0.6進行響應面實驗分析。

2.6 美洲大蠊多糖抗氧化活性研究

2.6.1 清除DPPH自由基能力的測定

參照Li等[8]和Feng等[9]方法，并做相應調整。精密稱取7.87 mg DPPH，無水乙醇定容至100 mL(0.02 mmol/L)。分別精取2 mL不同濃度(0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL)的樣品和維生素C(Vc)溶液，精加2 mL DPPH溶液，混合均勻，室溫放置30 min后，4 000 rpm離心10 min，取上清液于517 nm處測吸光度。

其中，A0：2 mL無水乙醇+2 mL DPPH溶液的吸光度；A1：2 mL樣品溶液+2 mL DPPH溶液的吸光度；A2：2 mL樣品溶液+2 mL無水乙醇的吸光度。

2.6.2 總還原能力的測定

參照Wang等[10]方法，并做相應修改。在10 mL離心管中分別精取0.025 mol/L pH 6.86的磷酸鹽緩沖液2 mL和不同濃度(0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24 mg/mL)的樣品和Vc溶液2 mL，精加2 mL 1%鐵氰化鉀，混勻后于50 ℃反應20 min。取出后精加2 mL 10%三氯乙酸終止反應，4 000 rpm離心10 min。精取上清液2 mL，精加入2 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1% FeCl3，混勻后靜置10 min，在700 nm處檢測吸光度。

還原能力=A1-A2

其中，A1：樣品組吸光度；A2：樣品本底吸光度(以等體積蒸餾水代替FeCl3溶液)。

2.6.3 羥自由基清除率的測定

參照Li等[11]方法，并做相應修改。精取9 mmol/L FeSO4、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液各1 mL，1 mL不同濃度(0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL)的樣品及Vc溶液。精加1 mL 1% H2O2啟動反應，37 ℃反應30 min，以蒸餾水為參比，在510 nm處測定各濃度樣品的吸光度。

式中，A0：1 mL水楊酸+ 1 mL FeSO4+1 mL水+1 mL H2O2；A1：1 mL水楊酸+ 1 mL FeSO4+1 mL樣品+1 mL H2O2；A2：1 mL水楊酸+ 1 mL FeSO4+1 mL樣品+1 mL H2O。

2.6.4 ABTS自由基清除能力的測定

參考Zhang等[12]方法，略作修改。將等體積7.4 mmol/L的ABTS和2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液混合，室溫避光下靜置12～16 h，制成ABTS儲備液。用pH 7.4的磷酸緩沖液稀釋儲備液，使其在734 nm下的吸光度在(0.70±0.02)，制成ABTS工作液。精取不同濃度(0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32 mg/mL)的多糖樣品及Vc溶液各1 mL，精加ABTS工作液6 mL，混合均勻，室溫下靜置6 min，測定734 nm下的吸光度。

其中，A0：1 mL 蒸餾水+ 6 mL ABTS工作液的吸光度；A1：1 mL樣品液+ 6 mL ABTS工作液的吸光度；A2：1 mL樣品液+ 6 mL蒸餾水的吸光度。

3 結果

3.1 單因素實驗結果

TFA用量考察結果：在水解溫度為110 ℃，水解時間8 h的條件下，TFA用量為3 mL時，單糖總峰面積達到最大；水解時間考察結果：在TFA用量為3 mL，水解溫度110 ℃條件下，水解1 h，單糖總峰面積達到最大；水解溫度考察結果：在TFA用量為3 mL，水解時間1 h的條件下，水解溫度為120 ℃時，單糖總峰面積達到最大。

3.2 美洲大蠊多糖水解的響應面結果

3.2.1 響應面設計及結果

根據單因素實驗所得結果進行響應面設計，PMP-HPLC柱前衍生法測定各組單糖總峰面積，響應面實驗設計及結果如表2所示。

表2 響應面實驗設計及結果(n=3)

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中所得的實驗數據進行分析，以單糖總峰面積Y對自變量進行模型擬合，通過決定系數(R2)和方差分析對擬合模型進行評價，通過比較各擬合方程的擬合度，得到二次多項回歸擬合方程：Y=4 763.08 + 187.18A+78.31B+ 512.01C-626.70AB-283.90AC+242.27BC-505.05A2-782.48B2-957.93C2。

表3 回歸模型的方差分析

3.2.2 響應面曲面分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件對實驗結果進行分析，作出響應面的3D和等高線分析圖，可以形象地反應出各自變量對總峰面積的影響。由圖1～3可知，在所選范圍內存在極值即響應面最高點，也是等值線最小橢圓的中心點，曲面坡度大，說明變化明顯；響應面圖能較直觀反映出各因素與響應值的關系及各個因素間的交互作用。此外，等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。由圖還可知，水解時間與水解溫度這兩者之間存在顯著的交互作用；而TFA用量和水解溫度之間無顯著交互作用；TFA用量和水解時間之間也無顯著交互作用；交互作用強弱為：AB>AC>BC，與方差分析結果一致。

圖1 水解時間和水解溫度等高線(a)及對單糖總峰面積(b)影響的響應面

圖2 TFA用量和水解時間等高線(a)及對單糖總峰面積影響的響應面圖(b)

圖3 TFA用量和水解溫度等高線(a)及對單糖總峰面積影響的響應面圖(b)

3.2.3 驗證實驗

響應面實驗預測的最佳水解條件為：水解時間1.04 h，水解溫度120.62 ℃，TFA用量3.26 mL，模型預測值為4 839.97。為了檢驗模型的可行性，考察預測結果的可靠性，在優(yōu)化的工藝參數下進行驗證試驗，考慮到實際操作條件，實際校正后將最佳工藝參數修正為：水解時間1 h，水解溫度120 ℃，TFA用量3.5 mL，所得總峰面積為4 740.15，與模型預測值相對誤差為2.1%。圖4為優(yōu)化條件下測定的美洲大蠊單糖及標準單糖液相色譜圖。

圖4 混合對照品(A)及美洲大蠊單糖組成(B)HPLC色譜圖

3.3 美洲大蠊多糖抗氧化活性結果

3.3.1 美洲大蠊多糖對DPPH自由基的清除能力

用“2.6.1”項方法測定Vc和美洲大蠊多糖對DPPH自由基的清除曲線，見圖5，隨著給藥濃度的增加，Vc和美洲大蠊多糖對DPPH自由基的清除能力增強，當美洲大蠊多糖濃度為0.08 mg/mL時，清除率為88.34%，此時，Vc的清除率為96.43%。美洲大蠊多糖對DPPH自由基清除作用的IC50數值為0.028 mg/mL，結果顯示美洲大蠊多糖有一定的清除DPPH自由基的能力。

圖5 美洲大蠊多糖對DPPH自由基的清除率

3.3.2 美洲大蠊多糖的還原能力

用“2.6.2”項方法測定Vc和美洲大蠊多糖的總還原能力，結果見圖6，隨著多糖和Vc濃度的增加，美洲大蠊多糖的還原力都出現較為明顯的上升。當Vc的濃度達到0.16 mg/mL時，吸光度值達到最大，為1.214；而當美洲大蠊多糖的濃度為0.16 mg/mL時，吸光度為0.667，雖還原能力不及Vc，但本實驗仍能證明美洲大蠊多糖具有一定的還原能力。

圖6 美洲大蠊多糖的總還原能力

3.3.3 美洲大蠊多糖對OH自由基的清除能力

由圖7可知，在多糖濃度為0.4～1.6 mg/mL時，OH自由基清除率隨著多糖濃度的增加而增加，當多糖濃度達到1.6 mg/mL時，清除率為94.28%，此時，Vc清除率為99.91%，二者清除能力較為接近。美洲大蠊多糖對OH自由基清除作用的IC50值為0.78 mg/mL，表明美洲大蠊多糖具有良好的清除OH自由基的能力。

圖7 美洲大蠊多糖對OH自由基的清除率

3.3.4 美洲大蠊多糖清除ABTS自由基的能力

由實驗結果(見圖8)可知，美洲大蠊多糖在0.01～0.16 mg/mL時，美洲大蠊多糖清除ABTS自由基能力曲線相對較陡，清除能力隨多糖濃度增加地較快；當多糖在0.16～0.32 mg/mL時，曲線較平緩；當多糖濃度為0.32 mg/mL，美洲大蠊多糖對ABTS自由基的清除率為97%，此時，Vc清除能力為102%。美洲大蠊多糖和Vc對ABTS自由基清除能力的IC50值分別為0.07、0.035 mg/mL，表明美洲大蠊多糖有一定的清除ABTS自由基的能力。

圖8 美洲大蠊多糖對ABTS自由基的清除率

4 結論與討論

本研究采用單因素實驗與響應面實驗相結合的方法，對美洲大蠊多糖的提取工藝條件進行了優(yōu)化，并對其抗氧化能力進行了初步評價。得到美洲大蠊多糖水解的最佳工藝條件為：水解時間1 h，水解溫度120 ℃，TFA用量3.5 mL，總峰面積為4 740.15?？寡趸钚詼y定結果表明，美洲大蠊多糖具有較好的抗氧化活性，其對DPPH、OH、ABTS自由基具有較好的清除能力，IC50分別為0.028、0.78、0.07 mg/mL，且具有一定的還原能力。Zhang等[13]發(fā)現霸王花多糖中半乳糖和阿拉伯糖的比例與其清除ABTS自由基的IC50存在一定的正相關性。Shang等[14]將5種食用真菌多糖的化學組成及單糖組成與抗氧化活性(IC50)進行Pearson相關性分析發(fā)現，巖藻糖、甘露糖和半乳糖的含量對多糖的ABTS自由基清除活力有影響；葡萄糖和甘露糖含量對多糖的OH自由基清除活力有顯著影響，巖藻糖含量和多糖的超氧陰離子的IC50值呈正相關。Ai[15]發(fā)現甘露糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖對茶多糖抗氧化活性有較大影響。相關文獻表明，多糖的抗氧化活性與其單糖組成及各單糖的含量有著密切關系。實驗發(fā)現美洲大蠊多糖對DPPH、OH、ABTS自由基具有較好的清除能力，HPLC測試結果發(fā)現其水解液含有甘露糖、鹽酸氨基葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖，摩爾比為17.0∶13.2∶9.6∶53.4∶21.8∶1.0∶4.6∶1.3；美洲大蠊多糖抗氧化作用可能與其單糖組成有關，而水解后的美洲大蠊多糖抗氧化活性能否保持或增加，有待實驗的進一步研究。