趙娜娜 王超 金惠新 趙陽 呂蓉

CD36抗原又稱為GPⅣ、GPⅢb、PASⅣ或FAT，是一種80KD大小的膜糖蛋白，廣泛存在于血小板、免疫細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腸細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、視網(wǎng)膜和乳腺上皮細(xì)胞以及微血管內(nèi)皮細(xì)胞上[1]。研究表明，CD36抗原缺失患者因輸血、移植、妊娠等免疫刺激而產(chǎn)生CD36同種抗體，可引起血小板輸注無效[2]、新生兒同種免疫性血小板減少癥[3]、輸血后紫癜[4]等。CD36是胞外基質(zhì)蛋白凝血酶敏感蛋白的受體，凝血酶敏感蛋白與血小板上的CD36 C-末端區(qū)域結(jié)合，能促進血小板的黏附。產(chǎn)生CD36抗體的患者，其血小板與膠原蛋白的黏附力下降，并且血小板CD36抗體能抑制血小板變形、聚集和分泌[5]。這些將會導(dǎo)致血小板的黏附、聚集和分泌功能下降，是導(dǎo)致血小板輸注無效（PTR）的次要原因。1989年IKEDA等[6]在一位日本血小板輸注無效患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)NaKa抗體，并證實NaKa抗原位于CD36分子上，此后發(fā)現(xiàn)血小板CD36抗原缺失與血小板輸注無效有關(guān)。近幾年，國內(nèi)外報道CD36抗體導(dǎo)致的血小板輸注無效病例增加，CD36抗原缺失已引起輸血界的高度關(guān)注。本研究建立了血小板CD36抗原流式檢測方法，并分析了合肥地區(qū)無償獻血者CD36抗原的缺失頻率，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

材料與方法

1 研究對象 隨機選取合肥地區(qū)2020年3月～2020年7月無償捐獻血小板獻血者共973例，年齡18～55歲。獲得知情同意后采集EDTA抗凝全血2 mL（4 ℃保存），于樣本采集24 h內(nèi)完成CD36抗原的流式檢測。

2 主要試劑與儀器 FITC熒光標(biāo)記抗人CD36單克隆抗體（購自法國Beckman CouLter公司，批號：200012），F(xiàn)ITC熒光標(biāo)記抗人IgG1單克隆抗體（購自法國Beckman CouLter公司，批號：200069），PE熒光標(biāo)記抗人CD14單克隆抗體（購自法國Beckman CouLter公司，批號：200042），DPBS basic（1X）（賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司，批號：8119439），EDTA/DPBS緩沖液（10 mmol/L EDTA溶于DPBS溶液，pH7.0～7.2），離心機（賽默飛世爾科技有限公司），混勻器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），BD管（FALCON），流式細(xì)胞儀（BD FACS Calibur，美國BD公司）。

3 方法

3.1 血小板CD36抗原流式方法檢測：取2 mL EDTA抗凝全血，混勻，100 g離心15 min分離上層富含血小板血漿（PRP），用3 mL EDTA/DPBS緩沖液洗滌，3 000 r/min離心5 min，洗滌2次后棄上清，再用EDTA/DPBS緩沖液將血小板稀釋至3.0×105/μL。取50 μL稀釋后的血小板懸浮液，加入2.5 μL FITC熒光標(biāo)記抗人CD36單克隆抗體，對照管加FITC熒光標(biāo)記抗人IgG1單克隆抗體，混勻，室溫、避光孵育30 min，用2 mL EDTA/DPBS緩沖液洗滌，2 500 r/min離心3 min，洗滌2次后棄上清，將標(biāo)記的血小板懸浮在300 μL EDTA/DPBS緩沖液中，混勻，流式細(xì)胞儀檢測，通過FSC/SSC設(shè)血小板門，分析血小板表面的幾何平均熒光強度（geometric mean fluorescence intensity，GMFI）。血小板CD36抗原陰性、陽性結(jié)果判斷：當(dāng)樣本的M1＜5%時（此時M2＞95%,因為M1+M2=100%）判定該樣本為陰性；當(dāng)樣本的M1＞5%時（此時M2＜5%）判定該樣本為陽性。

3.2 單核細(xì)胞CD36抗原流式方法檢測：取100 μL EDTA抗凝血，加入5 μL FITC標(biāo)記抗人CD36單克隆抗體、5 μL PE標(biāo)記抗人CD14單克隆抗體，混勻，避光、室溫孵育20 min后，再加入500 μL紅細(xì)胞裂解液，混勻，避光、室溫靜置15 min，加入2 mL～3 mL DPBS緩沖液洗滌，3 000 r/min離心5 min，棄上清（重復(fù)一次），再用500 μL DPBS緩沖液重懸細(xì)胞扣，混勻，流式細(xì)胞儀分析。 單核細(xì)胞CD36抗原陰性、陽性結(jié)果判斷：當(dāng)樣本的M2＜5%時（此時M1＞95%，因為M1+M2=100%）判定該樣本為陰性；當(dāng)樣本的M2＞5%時（此時M1＜5%）判定該樣本為陽性。

3.3 CD36抗原缺失分類的定義：流式細(xì)胞儀檢測獻血者血小板CD36抗原陰性后，對獻血者單核細(xì)胞進行檢測CD36抗原。若單核細(xì)胞CD36抗原為陰性，則該獻血者為CD36Ⅰ型缺失；若單核細(xì)胞CD36抗原為陽性，則該獻血者為CD36Ⅱ型缺失。

結(jié) 果

1 973例合肥地區(qū)無償獻血者CD36抗原檢測情況 血小板CD36抗原流式檢測和單核細(xì)胞CD36抗原流式檢測示意圖見圖1和圖2。共檢出血小板CD36抗原陽性者957例，血小板CD36抗原缺失者16例，缺失頻率為1.64%；其中Ⅰ型缺失2例，Ⅱ型缺失14例，缺失頻率分別為0.20%（2/973）和1.44%（14/973）。在血小板CD36抗原缺失者中，Ⅰ型缺失占12.50%（2/16）、Ⅱ型缺失占87.50%（14/16），CD36抗原檢測結(jié)果及分布情況（見表1）。

表1 CD36抗原的表達與分布情況

2 人群血小板CD36抗原表達差異 根據(jù)血小板上CD36抗原的幾何平均熒光強度GMFI發(fā)現(xiàn)，合肥地區(qū)無償獻血者血小板CD36抗原表達強度存在差異：16例CD36表達陰性（缺陷型），GMFI值為32.25±5.31；957例CD36表達陽性（非缺陷性），其中CD36抗原低表達有128例，其GMFI為165.57±27.76，CD36抗原中表達有686例，其GMFI為346.88±88.81，CD36抗原高表達有143例，其GMFI為 659.05±111.18。

圖1 血小板CD36 抗原流式表達示意圖

圖2 單核細(xì)胞CD36 抗原流式表達示意圖

討 論

隨著臨床血小板輸注量的增多，發(fā)現(xiàn)CD36抗原缺失者經(jīng)輸血、妊娠、移植等途徑帶來的免疫刺激后易產(chǎn)生抗CD36抗體，后者可導(dǎo)致血小板輸注無效、新生兒同種免疫血小板減少、輸血后紫癜等疾病，因此CD36抗原-抗體相關(guān)研究越來越被重視，已有的研究發(fā)現(xiàn)CD36缺失型在中國人群中占有相當(dāng)比例[7]。CD36抗原缺失分為2種類型：Ⅰ型為血小板和單核細(xì)胞都不表達CD36抗原；Ⅱ型僅是血小板缺失CD36抗原，而單核細(xì)胞上表達CD36抗原[8]。Ⅱ型缺失又被分為2個亞類，2a和2b，只是血小板缺乏CD36為2a；如果紅細(xì)胞也缺乏CD36，為2b[9]。Ⅱ型比Ⅰ型更常見。研究證實CD36缺失Ⅰ型的分子機制主要源于編碼區(qū)的基因突變[10]；Ⅱ型缺失的分子機制目前尚不明確。KASHIWAGI等[11]推測在CD36基因上或其附近存在一個“血小板特異性沉默等位基因”，該基因會影響CD36的表達。IMAI等[12]假設(shè)存在血小板限制調(diào)節(jié)因子，其導(dǎo)致CD36抗原Ⅱ型缺失，而XU等[13]研究發(fā)現(xiàn)起始密碼子上游的基因突變會導(dǎo)致CD36抗原表達低下，因此認(rèn)為在5′-UTR存在幾個潛在的順式調(diào)控元件對轉(zhuǎn)錄進行調(diào)控，最終導(dǎo)致血小板CD36抗原Ⅱ型缺失。也有研究發(fā)現(xiàn)有些CD36基因突變并不一定會引起CD36抗原缺失，有的只是會引起抗原表達量減少，甚至沒有影響[14]。

本次研究分析了合肥地區(qū)人群CD36抗原缺失頻率，在檢測的無償獻血者CD36抗原缺失頻率為1.64%。據(jù)報道非洲人缺失率較高，美國非裔為2.4%[15]，亞洲人群缺失率為5%～10%[1]，日本為3%～11%[16]，白種人缺失率僅為0%～0.3%[4]；國內(nèi)報道的CD36缺失分別為廣州2.10%[17]、深圳3.19%[18]、 長 春 3.45%[19]、 廣 西 4.13%[20]、 杭 州3.6%[13]，其中廣西壯族人群高達5.76%。由此可見，CD36抗原缺失率存在地區(qū)和種族差異，合肥地區(qū)缺失頻率較中國南部地區(qū)CD36缺失率略低。

目前多用流式細(xì)胞法檢測血小板CD36抗原，根據(jù)細(xì)胞在流式細(xì)胞儀上的前向角和側(cè)向角確定血小板區(qū)域，排除紅細(xì)胞、白細(xì)胞和碎片的干擾，并分析血小板區(qū)域的熒光強度。從本次結(jié)果分析，CD36抗原缺失者中A、B、O、AB血型個數(shù)均不低于2個，可為臨床輸注CD36抗原陰性血液患者提供幫助，也可為建立合肥地區(qū)無償獻血人群CD36抗原表達陰性資料庫的建立打下基礎(chǔ)。

本研究建立了血小板和單核細(xì)胞的CD36抗原流式檢測方法，并初步分析了合肥地區(qū)CD36抗原缺失頻率。血小板CD36抗原流式檢測方法的建立可用于對無償獻血者CD36抗原篩查及臨床病人血小板CD36抗原檢測，為血小板輸注無效并產(chǎn)生CD36抗體的患者尋找CD36抗原陰性血液制品提供基礎(chǔ)，但是本研究只進行了CD36抗原的調(diào)查，而缺失的分子機制還待進一步研究探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突