鄭艷 張茜 孫菲

甲狀腺癌是一種好發(fā)于女性的內(nèi)分泌系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤，近年來(lái)甲狀腺癌的發(fā)病率逐年增加，據(jù)報(bào)道，目前我國(guó)新發(fā)甲狀腺癌患者約占全身惡性腫瘤患者的3%，約占頭頸部惡性腫瘤患者的5%[1，2]。根據(jù)組織病理學(xué)特征，甲狀腺癌可分為乳頭狀癌、濾泡狀癌、髓樣癌及未分化癌等病理類(lèi)型，其中，以甲狀腺乳頭狀癌最為常見(jiàn)，約占甲狀腺癌總數(shù)的85%，而甲狀腺未分化癌最為少見(jiàn)，但惡性程度高，預(yù)后差[3，4]。目前，臨床上對(duì)于甲狀腺癌患者的主要治療手段包括手術(shù)切除、I131放射治療及內(nèi)分泌治療等[5]。早期患者能取得較好的治療效果，但容易出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)；而對(duì)于晚期患者，治療效果較差，5年生存率不容樂(lè)觀[6]。因此，探究甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找治療晚期甲狀腺癌患者的新途徑仍是當(dāng)前臨床醫(yī)生所關(guān)注的問(wèn)題。

本研究基于GEO（Gene Expression Omnibus）數(shù)據(jù)庫(kù)中人甲狀腺癌數(shù)據(jù)集GSE50901和GSE138198，使用R軟件進(jìn)行差異基因的篩選并利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因進(jìn)行驗(yàn)證，篩選出靶基因S100A1，隨后通過(guò)細(xì)胞和分子實(shí)驗(yàn)探究S100A1對(duì)人甲狀腺癌SW579細(xì)胞增殖的影響及其可能的作用機(jī)制，有望為探索甲狀腺癌藥物治療的新靶點(diǎn)提供依據(jù)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 人甲狀腺癌SW579細(xì)胞系購(gòu)自上海通派生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；RIPA裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；S100A1特異性siRNA序列（siS100A1）及對(duì)照組序列（siNeg）購(gòu)自蘇州泓迅生物科技股份有限公司；PC3.1-S100A1-HA過(guò)表達(dá)載體和對(duì)照組載體（PC3.1-EGFP-HA）購(gòu)自廣州云舟生物科技有限公司；HighGene轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8 （CCK-8）試劑盒和胰酶購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；抗S100A1一抗購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；抗β-catenin，c-myc和cyclinD1一抗均購(gòu)自美國(guó)CST（Cell Signaling Technology）公司；抗GAPDH一抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人甲狀腺癌SW579細(xì)胞使用DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%雙抗）常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組：按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)，將甲狀腺癌SW579細(xì)胞接種在6孔板中，“8”字法搖勻，細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌2次后加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基，將siRNA或質(zhì)粒按照比例（3 μL siRNA或3 μg質(zhì)粒對(duì)應(yīng)5 μL轉(zhuǎn)染試劑）混勻，室溫靜置15 min后加入6孔板中，搖勻，轉(zhuǎn)染48 h后提取總蛋白驗(yàn)證敲低及過(guò)表達(dá)效率，共包括4組，即敲低對(duì)照組（siNeg組），S100A1敲低組（siS100A1組），過(guò)表達(dá)對(duì)照組（EGFP組）和S100A1過(guò)表達(dá)組（S100A1組）。

2.3 細(xì)胞增殖檢測(cè)：將質(zhì)?；騭iRNA轉(zhuǎn)染48 h后的SW579細(xì)胞用胰酶消化重懸，均勻接種在96孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103個(gè)/孔。待接種8h、24 h、48 h和72 h后，加入CCK-8試劑，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔細(xì)胞吸光度值（OD Value，波長(zhǎng)450 nm）。

2.4 Western Blot：轉(zhuǎn)染48 h后，用胰酶消化，離心后收集細(xì)胞，加入200 μLRIPA裂解液提取總蛋白；BCA法定量后，取20 μg總蛋白進(jìn)行電泳分離；濕法轉(zhuǎn)膜及5%脫脂奶粉封閉后，根據(jù)目的蛋白分子大小裁膜，置入相應(yīng)的一抗（β-catenin，c-myc，cyclinD1和GAPDH）中孵育過(guò)夜；TBST洗膜后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h后使用ECL試劑盒進(jìn)行顯影及曝光，使用ImageJ軟件進(jìn)行定量分析。

2.5 RNA-Seq測(cè)序：收集轉(zhuǎn)染siNeg和siS100A1的SW579細(xì)胞，TRizol法提取總RNA，取0.5 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR以檢測(cè)siRNA的敲低效率，其余總RNA置于-80℃保存，由深圳華大基因股份有限公司完成RNA-Seq測(cè)序，使用GSEA4.0.3軟件進(jìn)行基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis）。

2.6 差異基因篩選及富集分析：數(shù)據(jù)集GSE50901和GSE138198下載自GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，使用R軟件及Limma包等功能包篩選差異基因，設(shè)置篩選條件為|log2（Fold Change）| ＞1且P.Val＜0.05，使用ggplot2、pheatmap等功能包進(jìn)行繪圖和數(shù)據(jù)可視化。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（ ±SEM）表示，使用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 甲狀腺癌生物信息學(xué)分析 選取GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中甲狀腺癌數(shù)據(jù)集GSE50901，共含有65個(gè)甲狀腺組織樣本，其中正常組織4個(gè)，甲狀腺癌組織61個(gè)，對(duì)該數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與正常甲狀腺組織相比，甲狀腺癌組織中有454個(gè)基因表達(dá)水平發(fā)生改變，其中208個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，246個(gè)基因表達(dá)上調(diào)（圖 1A）；選取GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)據(jù)集GSE138198，共含有17個(gè)甲狀腺組織樣本，其中正常組織3個(gè)，甲狀腺癌組織14個(gè)，對(duì)該數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與正常甲狀腺組織相比，甲狀腺癌組織中有2 324個(gè)基因表達(dá)水平發(fā)生改變，其中953個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，1 371個(gè)基因表達(dá)上調(diào)（圖1B）。

2 S100A1在甲狀腺癌中高表達(dá) 對(duì)數(shù)據(jù)集GSE50901和GSE138198進(jìn)行聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，有97個(gè)基因在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中均發(fā)生上調(diào)，46個(gè)基因均發(fā)生下調(diào)（圖2A），其中，S100A1基因在甲狀腺癌中高表達(dá)（圖2B和2C）。此外，對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中甲狀腺癌樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，甲狀腺癌組織的S100A1基因表達(dá)水平明顯上調(diào)（圖 2D）。

3 S100A1對(duì)甲狀腺癌SW579細(xì)胞增殖的影響 對(duì)人來(lái)源的正常甲狀腺細(xì)胞系HT-ori3和甲狀腺癌細(xì)胞系（TPC-1，K1，SW579，BCPAP）進(jìn)行S100A1蛋白檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌SW579細(xì)胞中S100A1蛋白水平顯著升高（圖 3A和3B）。通過(guò)siRNA干擾或者質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方式敲低或過(guò)表達(dá)SW579細(xì)胞的S100A1蛋白（圖 3C和3D），發(fā)現(xiàn)敲低S100A1能抑制SW579細(xì)胞的增殖，過(guò)表達(dá)S100A1則能促進(jìn)SW579細(xì)胞的增殖（圖 3E和3F）。

圖1 甲狀腺癌組織生物信息學(xué)分析

圖2 S100A1在甲狀腺癌組織中高表達(dá)

圖3 S100A1在甲狀腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)及對(duì)SW579細(xì)胞增殖的影響

4 S100A1對(duì)WNT/β-catenin信號(hào)通路的影響 為進(jìn)一步探究S100A1促進(jìn)甲狀腺癌SW579細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，本研究采用RNA-Seq測(cè)序分析，對(duì)基因表達(dá)矩陣進(jìn)行基因集富集分析（GSEA）發(fā)現(xiàn)，敲低SW579細(xì)胞中S100A1后，WNT信號(hào)顯著富集，且表現(xiàn)為信號(hào)通路活性降低（圖4A和4B）。Western blot結(jié)果表明，siS100A1組細(xì)胞中β-catenin，c-myc和cyclinD1的蛋白表達(dá)水平顯著低于siNeg組（圖4C和4E），而S100A1組細(xì)胞中β-catenin，c-myc和cyclinD1的蛋白表達(dá)水平顯著高于EGFP組（圖4D和4F）。

討 論

S100A1屬于鈣結(jié)合蛋白S100家族中的一員，其基因定位于人1號(hào)染色體長(zhǎng)臂21區(qū)，在體內(nèi)主要以同源二聚體的形式存在[7]。S100A1蛋白羧基末端含Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)與Ca2+結(jié)合，控制Ca2+內(nèi)流，引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致下游一系列改變[8]；同時(shí)，S100A1蛋白與Ca2+結(jié)合后會(huì)發(fā)生蛋白構(gòu)象改變，暴露出疏水裂隙，通過(guò)與不同的靶蛋白結(jié)合，參與調(diào)控各種生物學(xué)過(guò)程[9]。既往研究表明，S100A1廣泛參與調(diào)控細(xì)胞收縮、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化及基因轉(zhuǎn)錄等生物學(xué)過(guò)程[10，11]，而越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，S100A1在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥等[12，13]。GUO[14]等發(fā)現(xiàn)，S100A1在肝癌中高表達(dá)，并與腫瘤分級(jí)、分期及預(yù)后密切相關(guān)，通過(guò)與LATS1蛋白相互作用，調(diào)控下游Hippo信號(hào)通路從而影響肝癌細(xì)胞的增殖。TIAN[15]等發(fā)現(xiàn)，S100A1在卵巢癌腫瘤樣本中高表達(dá)，并與卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，進(jìn)一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)S100A1能顯著提高卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。這些研究提示，S100A1可能作為癌基因參與調(diào)控惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為密切相關(guān)，而目前關(guān)于S100A1對(duì)甲狀腺癌調(diào)控作用的報(bào)道較少。

本研究通過(guò)分析人甲狀腺癌數(shù)據(jù)集GSE50901和GSE138198，發(fā)現(xiàn)有97個(gè)基因在此兩個(gè)數(shù)據(jù)集中均發(fā)生上調(diào)，46個(gè)基因均發(fā)生下調(diào)，其中S100A1基因在甲狀腺癌中高表達(dá)。進(jìn)一步分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中甲狀腺癌組織樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)S100A1基因在腫瘤組織中明顯上調(diào)，提示S100A1基因的高表達(dá)可能參與甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展，因此本研究選擇S100A1基因進(jìn)行后續(xù)研究。為進(jìn)一步探究S100A1基因在甲狀腺癌中的作用，本研究檢測(cè)了敲低或過(guò)表達(dá)S100A1對(duì)人甲狀腺癌SW579細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，敲低S100A1能抑制SW579細(xì)胞的增殖，而過(guò)表達(dá)S100A1則能促進(jìn)SW579細(xì)胞的增殖，說(shuō)明S100A1在甲狀腺癌的細(xì)胞增殖中具有重要作用。

圖4 S100A1對(duì)WNT/β-catenin信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

為探究S100A1促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，本研究通過(guò)siRNA干擾的方式敲低SW579細(xì)胞的S100A1蛋白表達(dá)，隨后進(jìn)行RNA-Seq測(cè)序分析，對(duì)基因表達(dá)矩陣進(jìn)行基因集富集分析發(fā)現(xiàn)，敲低SW579細(xì)胞的S100A1后，WNT信號(hào)顯著富集，且表現(xiàn)為信號(hào)通路活性降低。WNT信號(hào)通路是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中一條高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，由WNT配體蛋白和膜蛋白受體及下游信號(hào)分子組成，其中最為經(jīng)典的是WNT/β-catenin信號(hào)，通過(guò)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，可引起β-catenin蛋白入核，與細(xì)胞核中不同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控下游靶基因Myc，CCND1等的表達(dá)[16]。既往研究表明，WNT/β-catenin信號(hào)通路在惡性腫瘤中異常激活，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、耐藥、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程[17]。邵宇鑫[18]等發(fā)現(xiàn)β-catenin在分化型甲狀腺癌中異常表達(dá)，并與其進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。張貴軍[19]等研究表明，β-catenin及WNT/β-catenin信號(hào)通路下游蛋白cyclin D1在甲狀腺癌組織中高表達(dá)，并與腫瘤病理類(lèi)型、臨床分期及轉(zhuǎn)移相關(guān)，這些研究均提示W(wǎng)NT/β-catenin信號(hào)通路激活與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，而抑制WNT/β-catenin信號(hào)通路活性能發(fā)揮抗甲狀腺癌作用。因此，為進(jìn)一步探究S100A1促進(jìn)甲狀腺癌SW579細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，本研究檢測(cè)了S100A1敲低或過(guò)表達(dá)對(duì)WNT/β-catenin信號(hào)通路活性的影響。Western blot結(jié)果表明，敲低S100A1能降低β-catenin，c-myc和cyclinD1蛋白表達(dá)水平，而過(guò)表達(dá)S100A1則能提高β-catenin，c-myc和cyclinD1的蛋白表達(dá)水平，說(shuō)明S100A1蛋白可能是通過(guò)調(diào)控WNT/β-catenin信號(hào)通路活性影響甲狀腺癌SW579細(xì)胞的增殖。為了深入探討WNT/β-catenin信號(hào)通路在S100A1蛋白介導(dǎo)的甲狀腺癌細(xì)胞增殖中的作用，后續(xù)研究需要在敲低S100A1蛋白的同時(shí)激活WNT/β-catenin信號(hào)通路，或過(guò)表達(dá)S100A1蛋白的同時(shí)使用抑制劑等方式抑制WNT/β-catenin信號(hào)通路以探究能否逆轉(zhuǎn)S100A1蛋白對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞增殖的影響。此外，本研究尚未探究S100A1調(diào)控WNT/β-catenin信號(hào)通路活性的具體機(jī)制，這也是后續(xù)進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

總之，本研究表明，S100A1在甲狀腺癌中高表達(dá)，敲低S100A1可能是通過(guò)抑制WNT/β-catenin信號(hào)通路活性從而抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖，S100A1可能成為潛在的甲狀腺癌藥物治療的新靶點(diǎn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突