楊偉偉，李艷飛，錢素敏

(滄州市中心醫(yī)院婦二科，河北 滄州 061001)

甲狀腺功能減退癥是常見的內(nèi)分泌疾病[1]。近年來，甲狀腺疾病的發(fā)生率呈逐年上升趨勢，且隨年齡的增長而增加。本病女性顯著高發(fā)，男女發(fā)病比例為1∶(4～5)[2]。甲狀腺功能減退對卵巢、子宮、胎盤及生育有不利影響[3]。黃芪甲苷(astragaloside IV，AST)為我國傳統(tǒng)中藥品種黃芪的主要有效成分之一，具有抗氧化、延緩衰老、促進(jìn)機(jī)體代謝和提高機(jī)體免疫力等多種藥理學(xué)活性[4]。本研究通過建立甲狀腺功能減退大鼠實驗?zāi)Ｐ?，觀察AST對大鼠子宮組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，探討AST干預(yù)甲狀腺功能減退癥對子宮的作用機(jī)制，為臨床提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4月齡SPF級Wistar雌性大鼠[北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，北京；實驗動物生產(chǎn)許可證號: SCXK(京)2016-0002]。遵偱3R原則，實驗過程中充分保證動物福利、給予動物人道關(guān)懷。大鼠自由飲水并飼以顆粒飼料，12 h晝夜循環(huán)，飼養(yǎng)溫度(22±2)℃，濕度(50±5)%。

1.2 儀器

Waters 600高效液相色譜儀(Waters公司，美國)；LabTech全自動紫外可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司，北京)；FT-1000生物張力傳感器和BL420N生物電信號采集系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司，成都)；Spectra MaxM4全波長酶標(biāo)儀(美國分子公司，美國)；Sigma 3K15型超速冷凍離心機(jī)(sigma公司，德國)，Milli-Q Academic超純水器(millipore公司，美國)。

1.3 試劑

AST(純度>98%；Aladdin公司，上海)；丙基硫氧嘧啶(propylthiouracil,PTU；上海朝暉藥業(yè)有限公司，上海；批準(zhǔn)文號：H31021082)；左甲狀腺素鈉片(默克公司，德國；批準(zhǔn)文號：H20140052)；三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、二磷酸腺苷(adeno-sine diphosphate，ADP)及一磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP) (Amresco公司，美國)；髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、一氧化氮(nitric oxide，NO)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)及考馬斯亮藍(lán)試劑盒(以上均為南京建成生物工程研究所，南京)。

1.4 方法

1.4.1 實驗分組及造模給藥 取4周齡SPF級Wistar雌性大鼠60只，體質(zhì)量(110±10)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按體質(zhì)量均衡原則，采用隨機(jī)數(shù)表法抽取10只大鼠作為對照組，除對照組外，其余大鼠以10 ml/kg體積給予0.1%的PTU溶液灌胃造模，對照組給予等體積自來水灌胃，1次/d，15 d后通過檢測血清三碘甲狀腺原氨酸、四碘甲狀腺原氨酸、游離三碘甲狀腺原氨酸、游離甲狀腺素、促甲狀腺激素水平驗證模型[5]。造模成功后將大鼠隨機(jī)分為5組：模型組，AST 20、40、80 mg/kg組及左甲狀腺素鈉9×10-3mg/kg組。16 d起，除對照組外，其余各組每隔1 d按10 ml/kg給予0.1%的PTU溶液灌胃，對照組給予等體積自來水灌胃。AST各劑量組按10 ml/kg相應(yīng)藥物(按人的常規(guī)日劑量與體表面積折算)分別灌胃，左甲狀腺素鈉9×10-3mg/kg組按10 ml/kg左甲狀腺素鈉灌胃，對照組和模型組等體積自來水灌胃，1次/d，連續(xù)給藥30 d。

1.4.2 標(biāo)本采集與檢測 末次給藥24 h后經(jīng)腹主動脈取血分離血清，同時頸椎脫臼法處死大鼠，開腹取兩側(cè)子宮組織，先取血清和左側(cè)子宮組織置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)錂z，右側(cè)子宮組織置于樂氏液的培養(yǎng)皿中備用。

1.4.3 大鼠血清MPO、CAT活力和NO含量測定 取上述備用的血清，依據(jù)試劑盒說明分別測定大鼠血清中CAT的活力和NO的含量，并用酶聯(lián)免疫吸附法檢測MPO水平。

1.4.4 離體子宮平滑肌灌流記錄子宮活動力 取上述備用的右側(cè)子宮，制備子宮平滑肌條，置于恒溫浴槽內(nèi)，用相應(yīng)的藥物灌流并用BL420N生物電信號采集系統(tǒng)記錄10 min時離體子宮平滑肌收縮張力(contraction tension, CT)、收縮頻率(contraction frequency, CF)，計算離體子宮活動力(uterine motility, UM)[6]。UM=CT×CF。

1.4.5 大鼠子宮組織SOD和GSH-Px活性，MDA和LDH含量以及Ca2+濃度檢測 在離體子宮平滑肌灌流實驗結(jié)束后，先取上述備用的左側(cè)子宮組織制成勻漿，依據(jù)試劑盒說明分別測定大鼠子宮組織中SOD、GSH-Px活性，MDA、LDH含量和Ca2+濃度。

1.4.6 子宮組織中高能磷酸化合物檢測 取左側(cè)子宮組織制成勻漿，采用HPLC測定ATP、ADP、AMP含量，并計算子宮總腺嘌呤核苷酸(total adenine nucleotides，TAN)總量(TAN=ATP+ADP+AMP)。色譜條件：流動相由215 mmol/L KH2PO4與3.5%乙腈組成，三乙胺調(diào)pH值至6.1，流速0.5 ml/min，檢測波長210 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μl[7]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清中MPO、CAT活性和NO含量比較

與對照組相比，模型組大鼠血清中MPO活力顯著升高、CAT活力明顯降低、NO含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，AST 40、 80 mg/kg組和左甲狀腺素鈉9×10-3mg/kg組MPO活性明顯降低、CAT活性升高、NO含量顯著降低(P<0.05)；與左甲狀腺素鈉組相比，AST 80 mg/kg組MPO、CAT活性和NO含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；表1)。

表1 各組大鼠血清MPO、CAT活性和NO含量比較

Table 1 Comparison of serum MPO, CAT and NO among rats of all groups

2.2 各組大鼠子宮組織中SOD和GSH-Px活性，MDA和LDH含量比較

與對照組相比，模型組大鼠子宮組織中SOD、GSH-Px活性顯著降低，MDA、LDH含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，AST 40、 80 mg/kg組和左甲狀腺素鈉9×10-3mg/kg組大鼠SOD、GSH-Px活性顯著升高，MDA、LDH含量顯著降低(P<0.05)；與左甲狀腺素鈉組相比，AST 80 mg/kg組SOD、GSH-Px活性和MDA、LDH含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；表2)。

表2 各組大鼠子宮組織SOD和GSH-Px活性，MDA和LDH含量比較

Table 2 Comparison of uterine tissues SOD, GSH-Px, MDA and LDH among rats of all groups

2.3 各組大鼠子宮組織HEP水平比較

與對照組相比，模型組ATP、ADP、AMP、TAN水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；AST 40、 80 mg/kg組和左甲狀腺素鈉9×10-3mg/kg組子宮組織中ATP、ADP、AMP和TAN均明顯升高(P<0.05)；與左甲狀腺素鈉組相比，AST 80 mg/kg組ATP、ADP、AMP和TAN差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；表3)。

表3 各組大鼠子宮組織ATP、ADP、AMP和TAN含量比較

Table 3 Comparison of ATP, ADP, AMP and TAN in uterine tissues among rats of all groups

2.4 各組大鼠離體子宮組織Ca2+濃度比較

與對照組相比，模型組離體子宮平滑肌CT、CF和UM、Ca2+濃度均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，AST 40、80 mg/kg組和左甲狀腺素鈉9×10-3mg/kg組CT、CF和UM和Ca2+濃度均明顯升高(P<0.05)；與左甲狀腺素鈉組相比，AST 80 mg/kg組CT、CF和UM和Ca2+濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05;表4)。

3 討 論

甲狀腺功能減退癥是多種原因引起的甲狀腺激素合成或分泌不足，導(dǎo)致機(jī)體生物效應(yīng)下降的內(nèi)分泌疾病，且女性患者居多，并常伴有生殖功能的改變，主要通過下丘腦-垂體-性腺軸來發(fā)揮調(diào)節(jié)機(jī)制。甲狀腺功能減退可引起子宮氧化應(yīng)激反應(yīng)[8]，如活性氧基團(tuán)產(chǎn)生過多[9]，自由基氧化功能與抗氧化功能失調(diào),導(dǎo)致體內(nèi)清除自由基的酶和非酶系統(tǒng)防御功能減退，如MPO、CAT、NO、MDA、SOD和GSH-Px等[10-12]。黃芪為豆科草本植物蒙古黃芪、膜莢黃芪的根，味甘性微溫，為我國傳統(tǒng)中藥品種。AST為黃芪的主要有效成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗自由基、提高機(jī)體免疫力等多種藥理學(xué)活性。本研究發(fā)現(xiàn)與陽性藥物左甲狀腺素鈉相比，AST 80 mg/kg更能提高機(jī)體抗氧化酶的活性，使子宮組織免受過脂質(zhì)過氧化的破壞，減輕細(xì)胞的損傷程度，進(jìn)而起到保護(hù)氧化應(yīng)激損傷的作用。

甲狀腺功能改變，引起能量代謝障礙[13]，脂肪酸和葡萄糖的有氧氧化受阻，僅靠糖的無氧酵解來提供ATP，這樣提供的ATP量很少，且效率很低。乳酸是糖酵解終產(chǎn)物，相應(yīng)的LDH活力會升高，這一現(xiàn)象將引發(fā)細(xì)胞代謝紊亂和功能異常。由于ATP水平降低不能提供組織所需能量時，機(jī)體將依次降解ADP、AMP、腺苷、次黃嘌呤以提供組織所需能量，進(jìn)一步造成體內(nèi)ATP、ADP、AMP及TAN水平降低[14]。細(xì)胞因能量供給不足而出現(xiàn)代謝紊亂，并最終造成結(jié)構(gòu)破壞及功能異常。因此，改善和保證高能磷酸化合物的正常代謝是糾正甲狀腺功能低下引起的能量代謝障礙，維持組織器官正常功能的前提。本研究顯示，AST 80 mg/kg組離體子宮平滑肌中ATP、AMP、ADP和TAN均較模型組和左甲狀腺素鈉組明顯提高、LDH活力降低，提示AST 80 mg/kg較左甲狀腺素鈉具有更好地促進(jìn)組織能量代謝、增強(qiáng)組織供能，從而改善和糾正甲狀腺功能低下引起的子宮能量代謝障礙。

表4 各組大鼠子宮組織Ca2+濃度、CT、CF和UM比較

Table 4 Comparison of Ca2+, CT, CF and UM concentration in uterine tissues among rats of all groups

為進(jìn)一步研究甲狀腺功能減退后能量代謝障礙與UM的關(guān)系，本研究還觀察了不同灌流方法對離體UM和Ca2+濃度的影響，發(fā)現(xiàn)AST 80 mg/kg較模型組和左甲狀腺素鈉組相比，離體子宮平滑肌CT、CF、UM和Ca2+濃度均明顯升高，提示其可促使Ca2+通道開放并促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，以增強(qiáng)子宮收縮力。這進(jìn)一步證實AST 80 mg/kg可能通過開放Ca2+通道而增強(qiáng)離體子宮平滑肌的敏感性，并通過促進(jìn)能量代謝而發(fā)揮對子宮的保護(hù)作用，其作用強(qiáng)于左甲狀腺素鈉。

綜上，目前臨床上治療甲狀腺功能減退癥引起的子宮功能低下癥狀尚缺乏較全面有效的療法。本研究證實，AST 80 mg/kg能有效降低甲狀腺功能減退大鼠子宮氧化應(yīng)激損傷的作用，且具有一定劑量依賴性，可為臨床應(yīng)用提供相關(guān)的實驗依據(jù)，其作用機(jī)制可能與AST能有效改善抗氧化酶活性、提高機(jī)體清除自由基能力以及開放Ca2+通道、增強(qiáng)子宮平滑肌的敏感性、促進(jìn)能量代謝有關(guān)。