武 婕，陳 燕，杜曉宣*

(1.廣東省深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院麻醉科，廣東 深圳 518109；2.新疆烏魯木齊市新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院麻醉科，新疆 烏魯木齊 830002)

顱腦損傷[1-2](traumatic brain injury,TBI)是發(fā)生于頭皮、顱骨和腦部的一種常見外傷，具有較高的病死率，臨床表現(xiàn)為意識障礙、頭昏嘔吐，重型顱腦損傷常伴隨患者代謝及生命體征紊亂、腦性水腫等癥狀，嚴重影響患者的生存質(zhì)量，現(xiàn)階段治療常以顱內(nèi)壓監(jiān)護、亞低溫治療、脫水治療等非手術(shù)治療手段為主，仍缺乏特效的臨床解決方案。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells)是一類具有多向分化潛能的干細胞[3-4]。近年來隨著干細胞移植治療研究的發(fā)展，越來越多的證據(jù)表明干細胞治療組在一定條件下能夠改善創(chuàng)傷性腦組織的結(jié)構(gòu)與功能[5]，但對神經(jīng)系統(tǒng)受損區(qū)域的穩(wěn)定修復(fù)效果受繼發(fā)性出血、缺血性細胞壞死及自由基作用的影響仍有待提升。另一方面，前期研究表明舒芬太尼[6]及丙泊酚[7-8]分別對TBI模型大鼠神經(jīng)元再生、大腦缺血缺氧損傷及神經(jīng)功能的發(fā)揮具有重要作用，同時，臨床工作經(jīng)驗也表明，舒芬太尼聯(lián)合丙泊酚對創(chuàng)傷性腦損傷具有保護作用。本研究旨在觀察舒芬太尼丙泊酚靜脈復(fù)合麻醉對骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療創(chuàng)傷性腦損傷大鼠行為學(xué)及病理學(xué)變化的影響，探究骨髓間充質(zhì)干細胞移植、舒芬太尼丙泊酚靜脈復(fù)合麻醉治療TBI大鼠的作用機制。

1 材 料 與 方 法

1.1材料 舒芬太尼(人福醫(yī)藥)；丙泊酚(四川國瑞藥業(yè))；水合氯醛(成都科龍化工試劑廠)；PBS、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶等購自Hyclone；多聚甲醛、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；電子顱腦損傷儀(Custom Design&Fabrication, Inc)；電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(上海宏達公司)；原位缺口粒端標記(TUNEL)法試劑盒、S100β ELISA試劑盒(Roche)；鬼比環(huán)肽(QIAGEN)；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒均購自生工；山羊抗兔IgG、白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、Bcl2-Associated X的蛋白質(zhì)(Bax)、B淋巴細胞瘤2(B-cell lymphoma 2，Bcl-2)、細胞色素C(cytochrome C,Cytc)的抗體均購自Abm；TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購自天根生物；PCR引物委托生工生物工程有限公司設(shè)計合成，引物序列見表1。

1.2實驗動物與分組治療

1.2.1實驗動物 干細胞治療組供體動物：無特定病原體(specific pathogens free, SPF)級幼年雄性Wistar大鼠5只，2～4周齡，體重(100±10) g；干細胞治療組受體動物：SPF級成年雄性Wistar大鼠45只，體重(200±20)g，均購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。大鼠于25～27 ℃恒溫，50%～70%恒濕，每12 h晝夜戒律交替條件下分籠飼養(yǎng)，動物實驗操作符合實驗動物保護條例，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后正式開始實驗。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.2骨髓間充質(zhì)干細胞(干細胞治療組)的分離及培養(yǎng) 參照文獻報道方法，分離大鼠股骨和脛骨，暴露骨髓腔。生理鹽水沖洗并收集骨髓腔沖洗液，1 000 r/min 4 ℃低速離心10 min，用含質(zhì)量分數(shù)10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基1 mL重懸下層細胞沉淀并轉(zhuǎn)移培養(yǎng)至T25培養(yǎng)瓶中，全程無菌操作[9]。常規(guī)培養(yǎng)并觀察干細胞治療組細胞生長情況，穩(wěn)定傳代3次后可用于后續(xù)實驗操作。

1.2.3動物分組造模及治療方法 受試大鼠隨機分為對照組、干細胞治療組及聯(lián)合治療組3組，每組15只。各組大鼠于造模干細胞治療組前12 h禁水禁食，以0.7 mL/kg比例給予大鼠腹腔注射5%水合氯醛麻醉，行俯臥位固定大鼠于立體定向支架上。剃毛暴露術(shù)區(qū)，75%乙醇消毒后沿頭正中線切開頭皮，剝離右側(cè)頂骨后以前囟為原點，用磨鉆磨開直徑約5 mm骨窗使完整硬腦膜完全暴露。使用電子顱腦損傷儀(electric cortical contusion impactor,eCCI)構(gòu)建重度TBI模型大鼠，eCCI打擊參數(shù)設(shè)置參照文獻報道方法[10]。造模完成后縫合切口并再次消毒，將大鼠放回籠中飼養(yǎng)。首次造模3 h后，經(jīng)尾靜脈給予聯(lián)合治療組1×105/mL干細胞治療組懸液0.5 mL、舒芬太尼0.5 g/kg和丙泊酚2.0 mg/kg，復(fù)合麻醉劑量選擇參照李文亮等[11]方法；干細胞治療組給予尾靜脈注射干細胞治療組懸液0.5 mL；對照組尾靜脈給予等體積生理鹽水。3組每日同一時間給予上述處理1次，共治療3周。

1.3大鼠神經(jīng)功能評定 每組各抽取6只大鼠，依據(jù)改良的神經(jīng)功能缺陷評分量表(modified neurological severity scales,mNSS)[12]對大鼠治療后3 d、7 d、14 d及21 d各階段神經(jīng)功能進行打分評定，0～18分，分數(shù)越高代表神經(jīng)系統(tǒng)功能損害越嚴重，重復(fù)測定3次比較均值。

1.4HE染色檢測大鼠腦組織形態(tài)學(xué) 治療結(jié)束后大鼠常規(guī)脫頸處死，斷頭分離腦組織，取視交叉位置后1 mm及6 mm處冠狀切割修整組織塊，制備海馬組織石蠟切片，經(jīng)HE染色、裝片后于光學(xué)倒置顯微鏡下觀察并記錄3組腦組織形態(tài)學(xué)變化。

1.5干濕比重法測定大鼠腦組織水含量 取腦損傷區(qū)域30 mg皮層組織置于-80 ℃快速降溫凍存，提取RNA。剩余部分吸干表面水分后立即置于分析天平中稱量腦組織濕重；轉(zhuǎn)移至干燥玻璃培養(yǎng)皿中60 ℃烘干48 h稱量腦組織干重。參照Elliott公式計算各組大鼠腦組織水含量，取均值比較。

1.6大鼠腦組織總鈣含量與血清S100β含量測定

1.6.1大鼠腦組織總鈣含量 取部分大鼠腦組織置于4 mL混合酸(高氯酸∶硝酸=1∶4)中，超純水定容至7 mL，混勻，參照文獻采用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀掃描測定大鼠腦組織總鈣含量[13]。

1.6.2大鼠血清S100β含量測定 取治療結(jié)束后活體大鼠頸靜脈血1～2 mL，室溫靜置30 min后4 000 r/min低速離心10 min，取上層血清，參照S100β酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒說明書操作測定S100β含量。

1.7大鼠腦組織細胞凋亡檢測

1.7.1TUNEL法檢測各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)(apoptotic index,AI) 參照TUNEL凋亡檢測試劑盒說明書對大鼠腦組織石蠟切片行抗體檢測，TUNEL陽性細胞熒光顯微鏡下發(fā)散紅色熒光，鬼比環(huán)肽標記細胞骨架呈綠色熒光定位細胞質(zhì)，隨機取5個視野拍照并記錄細胞總數(shù)和陽性細胞數(shù)，取均值計算AI=(陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%。

1.7.2Western Blot檢測大鼠腦組織凋亡相關(guān)蛋白表達 取各組大鼠腦組織50 mg勻漿裂解組織蛋白30 min，裂解產(chǎn)物于4 ℃ 12 000 r/min低速離心15 min，收集上清。經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒定量檢測蛋白含量后各取50 g蛋白，加入等量含1 mmol/L DTT的1×SDS上樣緩沖液煮沸變性蛋白。行10%SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后將上述蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，常規(guī)抗體孵育后顯色曝光以GAPDH為內(nèi)參，檢測目的蛋白表達，所得結(jié)果為比值。

1.8大鼠腦組織炎癥因子表達檢測

1.8.1免疫組織化學(xué)檢測大鼠腦組織IL-6、TNF-α、IL-1β表達分布 對大鼠腦組織石蠟切片行免疫組織化學(xué)抗體檢測，DAB顯色液顯色反應(yīng)5～10 min，顯微鏡下觀察并用PBS沖洗終止顯色。常規(guī)裝片后于放大200倍的光鏡下隨機取5個視野觀察并采集圖像，觀察IL-6、TNF-α、IL-1β在各組大鼠腦組織中的表達分布差異。

1.8.2qRT-PCR檢測大鼠腦組織中相關(guān)炎性因子mRNA表達 取凍存的腦組織20 mg，充分剪碎研磨參照TRIzol試劑說明書提取大鼠腦組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNAs，參照qRT-PCR試劑盒說明書定量檢測IL-6、TNF-α、IL-1β相關(guān)mRNA表達變化。設(shè)置反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min，隨后按95 ℃變性1 min、55 ℃退火2 min、72 ℃延伸1 min的程序設(shè)置40次循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后在95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s條件下做溶解曲線。以GAPDH為內(nèi)參，每個樣品均配3個副孔，同時做陰性對照組排除PCR污染及引物二聚體干擾。以采集到的熒光信號值(Ct值)，計算2-△△Ct值分析腦水腫相關(guān)炎性因子mRNA在各組大鼠腦組織中表達水平的變化。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1干細胞治療組細胞形態(tài)學(xué)觀察 干細胞治療組新鮮提取的原代細胞貼壁后呈均勻的梭形，核居中，個別細胞呈現(xiàn)星形或扁平狀多邊形態(tài)，細胞以分散的單克隆聚集方式增殖，細胞液中漂浮有懸浮細胞，見圖1A。干細胞治療組純化及傳代培養(yǎng)1周后，非貼壁細胞逐漸減少，貼壁的細胞融合至密度為95%，見圖1B。1∶2傳代后細胞呈放射狀或旋渦狀集落生長趨勢，細胞形態(tài)隨傳代次數(shù)增加逐漸穩(wěn)定均一，最終穩(wěn)定生長為梭形成纖維細胞樣。

圖1 干細胞治療組鏡下觀察的細胞形態(tài)(HE ×200 )

2.23組mNSS比較 TBI造模結(jié)束后治療3 d內(nèi)，3組mNSS評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療7 d后，聯(lián)合治療組mNSS評分顯著低于對照組；治療14 d、21 d后干細胞治療組及聯(lián)合治療組評分均顯著低于對照組，聯(lián)合治療組低于干細胞治療組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3HE染色觀察腦組織形態(tài)學(xué)改變 HE染色結(jié)果顯示，TBI后對照組神經(jīng)元細胞胞體出現(xiàn)形狀改變，細胞核呈現(xiàn)固縮、深染，細胞間間隙異常增大；神經(jīng)元細胞可見排列松散，并伴有大量壞死。干細胞治療組與聯(lián)合治療組海馬組織較對照組病理學(xué)變化顯著改善，且聯(lián)合治療組腦組織神經(jīng)細胞密度顯著恢復(fù)，海馬區(qū)細胞排列整齊，細胞核完整且著色較淺，較干細胞治療組治療效果更佳。見圖2。

表2 造模后不同時間段內(nèi)3組大鼠mNSS評分比較Table 2 Comparison of mNSS Score in different time periods after modeling among three groups

圖2 HE染色觀察大鼠海馬組織病理變化( ×200)

2.43組腦組織含水量、總鈣含量及血清S100β含量比較 干細胞治療組及聯(lián)合治療組腦組織水含量、總鈣含量及血清S100β含量均低于對照組，聯(lián)合治療組低于干細胞治療組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

2.53組腦組織細胞凋亡比較 干細胞治療組、聯(lián)合治療組腦組織細胞凋亡數(shù)目及Caspase-3、Bax、Cytc蛋白表達量低于對照組，聯(lián)合治療組低于干細胞治療組，干細胞治療組、聯(lián)合治療組Bcl-2蛋白表達高于對照組，聯(lián)合治療組高于干細胞治療組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4，圖3。

2.63組腦組織中相關(guān)炎性因子表達比較 3組腦組織切片IL-6、IL-1β陽性產(chǎn)物呈棕褐色深染，于對照組大鼠腦部海馬組織中密集表達分布，干細胞治療組及聯(lián)合治療組大鼠中可見表達減少，IL-6、IL-1β陽性反應(yīng)減弱；TNF-α陽性產(chǎn)物呈藍紫色深染，同樣在對照組組中顯示出高表達彌散分布，于治療組中表達減少，見圖4。干細胞治療組、聯(lián)合治療組IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達水平均低于對照組，聯(lián)合治療組低于干細胞治療組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

表3 3組大鼠腦組織水含量、總鈣含量和血清S100β含量比較Table 3 Comparison of brain water content, total calcium content and serum S100 β content among three groups

圖3 3組大鼠腦組織TUNEL染色及凋亡蛋白表達

表4 3組大鼠腦組織細胞凋亡指數(shù)及凋亡蛋白相對表達水平比較Table 4 Comparison of apoptosis rate and relative protein expression levels in three groups

圖4 3組大鼠腦組織炎性因子表達及分布(免疫組織化學(xué) ×200)

表5 3組大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達比較Table 5 Relative IL-6,IL-1β,TNF-α mRNA expression levels in three groups

3 討 論

骨髓間充質(zhì)干細胞移植已經(jīng)成為顱腦損傷治療的研究熱點，其顱內(nèi)移植途徑主要包括側(cè)腦移植、靜脈移植、腹腔移植、動脈移植以及鼻腔內(nèi)移植[14]，其中靜脈移植和經(jīng)腹腔移植方法以簡單、不良反應(yīng)小、對宿主傷害弱受到廣泛應(yīng)用。大量研究表明，移植至損傷腦組織區(qū)的干細胞治療組可通過細胞分化替代宿主細胞、分泌神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF)等神經(jīng)營養(yǎng)因子、促進CXC等趨化因子分泌促進干細胞歸巢、調(diào)控細胞因子表達及新生血管形成等途徑對TBI發(fā)揮治療作用[15]，但真正將干細胞治療組移植應(yīng)用于TBI的臨床治療，干細胞治療組的具體作用機制及移植治療的安全性等問題仍有待探索。與此同時，舒芬太尼與丙泊酚作為臨床經(jīng)典麻醉藥已被廣泛應(yīng)用于TBI患者的臨床手術(shù)麻醉及康復(fù)治療，其中舒芬太尼是一種新型阿片受體激動劑，能夠有效抑制細胞凋亡和炎性反應(yīng)過度表達對缺血后大腦損傷發(fā)揮保護作用；丙泊酚是一種γ-氨基丁酸受體激動劑，能通過調(diào)控Ca2+電壓門控通道及抗氧化活性機制對受損神經(jīng)起到治療作用。本研究結(jié)果顯示，干細胞治療組移植治療與舒芬太尼、丙泊酚等藥物治療相結(jié)合對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的綜合治療效果顯著，為此，筆者對3者的聯(lián)合作用機制進行了深入探究。

治療期間由mNSS評分可知，治療14 d后，聯(lián)合治療組較干細胞治療組對大鼠神經(jīng)功能缺陷恢復(fù)的治療效果顯著增強，舒芬太尼聯(lián)合丙泊酚在干細胞治療組單一治療的基礎(chǔ)上促進TBI大鼠腦損傷修復(fù)，同時HE染色可見創(chuàng)傷性大鼠腦部海馬區(qū)病理變化得到顯著改善。查閱相關(guān)文獻可知，創(chuàng)傷性腦損傷機制及病理組織形態(tài)學(xué)的變化與腦水腫、細胞內(nèi)鈣荷載及血清S100β等顯著相關(guān)，因此通過檢測腦組織水含量可知聯(lián)合治療組大鼠腦組織水含量及總鈣含量顯著低于干細胞治療組與單一治療組，提示舒芬太尼聯(lián)合丙泊酚對降低腦水腫、抑制鈣超載的作用更強，促進創(chuàng)傷性腦損傷修復(fù)；同時治療組腦組織總鈣含量的減少表明創(chuàng)傷性損傷與組織細胞鈣超載有關(guān)，聯(lián)用舒芬太尼與丙泊酚可有效減輕腦組織總鈣含量、逆轉(zhuǎn)TBI腦損傷。另一方面，S100β作為神經(jīng)組織蛋白之一在體內(nèi)發(fā)揮營養(yǎng)膠質(zhì)細胞、促進神經(jīng)元生長的作用，可通過與游離的Ca2+結(jié)合形成穩(wěn)定結(jié)合鈣，誘導(dǎo)神經(jīng)細胞的凋亡，本研究結(jié)果可知，聯(lián)合治療組治療較干細胞治療組顯著抑制大鼠體內(nèi)S100β含量，這提示干細胞治療組聯(lián)合舒芬太尼與丙泊酚治療TBI大鼠腦損傷可能與抑制神經(jīng)細胞凋亡、促進腦部炎癥損傷修復(fù)相關(guān)。因此進一步檢測腦組織細胞凋亡及炎性因子表達變化，結(jié)果顯示聯(lián)合治療組較干細胞治療組大鼠腦部海馬組織神經(jīng)細胞凋亡率顯著降低，細胞內(nèi)促凋亡關(guān)鍵因子Caspase-3、Bax、Cytc蛋白表達較干細胞治療組顯著降低，且舒芬太尼聯(lián)合丙泊酚對Cytc蛋白表達抑制更為顯著，提示聯(lián)合治療組可能通過抑制線粒體凋亡途徑抑制受損神經(jīng)細胞凋亡，同時促進抗凋亡蛋白Bcl-2表達，進而影響神經(jīng)細胞形態(tài)穩(wěn)定及神經(jīng)元生長實現(xiàn)對TBI大鼠的治療作用，進而推測舒芬太尼聯(lián)合丙泊酚對干細胞治療組治療TBI大鼠可能受到PI3K/Akt/GSK3β信號通路級聯(lián)反應(yīng)的調(diào)控。另外，丙泊酚同時參與Ca2+門控通道的調(diào)節(jié)，其與舒芬太尼聯(lián)用能阻斷神經(jīng)元神經(jīng)信號傳導(dǎo)、改善損傷區(qū)域炎癥微環(huán)境，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示聯(lián)合治療組大鼠治療后腦部IL-6、IL-1β、TNF-α分布較干細胞治療組顯著減少，同時qPCR結(jié)果顯示腦組織中IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達水平與組織炎性因子分布呈正相關(guān)，為改善TBI后大鼠顱內(nèi)炎癥反應(yīng)、組織水腫提供可能。

綜上所述，舒芬太尼丙泊酚靜脈復(fù)合麻醉對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠神經(jīng)修復(fù)具有保護作用，舒芬太尼聯(lián)合丙泊酚在干細胞治療組移植治療中可緩解腦水腫、細胞鈣超載及循環(huán)S100β的積聚，促進血液循環(huán)和微環(huán)境調(diào)節(jié)，抑制神經(jīng)細胞凋亡和炎性介質(zhì)的表達，促進神經(jīng)元的再生及修復(fù)，改善腦組織病理變化及受損神經(jīng)功能缺陷，為臨床康復(fù)采用干細胞治療組移植治療腦損傷提供了新的思路和方法。