孔夢(mèng)玉，劉曉芳，武金寶

(1.包頭醫(yī)學(xué)院2018級(jí)碩士研究生，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2. 包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院病理科；3.包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院內(nèi)蒙古消化病研究所)

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)是一種慢性特發(fā)性炎癥性疾病。在病理學(xué)上UC是一種局限于結(jié)腸黏膜和結(jié)腸黏膜下層的慢性炎癥性腸病，累及部分或全部結(jié)腸，主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、里急后重、黏液膿血便，其為慢性病程，病情輕重不等，有終生復(fù)發(fā)傾向。據(jù)報(bào)道，全球UC患病率為(2.42～298.5)/10萬，其中北美和北歐的發(fā)病率最高，且UC在全球范圍內(nèi)發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[1-3]。UC的發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前認(rèn)為由多種因素相互作用所致，包括腸上皮屏障破壞、腸道反應(yīng)相關(guān)通路中的遺傳缺陷、包括益生菌群失調(diào)在內(nèi)的環(huán)境影響及免疫因素等[4-5]。目前，對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的診斷、病程監(jiān)測(cè)以及UC患者對(duì)干預(yù)措施的反應(yīng)和粘膜愈合(MH)的檢測(cè)依賴于臨床評(píng)估、糞便或血清學(xué)生物標(biāo)志物及結(jié)腸鏡檢查，其中結(jié)腸鏡檢查是“金標(biāo)準(zhǔn)”。

由于UC有反復(fù)發(fā)作，病程遷延的特點(diǎn)，故需要長(zhǎng)期維持治療。目前維持治療用藥選擇依然有限，主要為氨基水楊酸制劑。雖然糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物對(duì)于UC也有較好的療效，但由于有較多且嚴(yán)重的副作用，使它們不能用于UC的長(zhǎng)期維持治療?；⒌啬c溶膠囊具有清熱、利濕、涼血的功效，其作為新型中藥用于UC的臨床治療已經(jīng)十余年，對(duì)于緩解UC患者腹痛、黏液膿血便的癥狀效果顯著，尤其針對(duì)輕、中度UC具有較好的療效，但對(duì)于其相關(guān)的研究報(bào)道較少，其作用機(jī)制尚不清楚。DSS飲水法被廣泛應(yīng)用于急、慢性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制、藥物藥效的研究[6]。

因此本實(shí)驗(yàn)采用DSS飲水法建立UC大鼠模型，通過用虎地腸溶膠囊內(nèi)容物干預(yù)造模大鼠，與對(duì)照組大鼠進(jìn)行比較，選取大鼠一般情況、大便隱血評(píng)分、疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分(DAI)、組織病理學(xué)表現(xiàn)、反應(yīng)腸上皮屏障功能相關(guān)因子(ZO-2、Occludin)、腸黏膜保護(hù)性因子(AQP4、HSP70)作為療效評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)比分析各組指標(biāo)的差異，探究虎地腸溶膠囊對(duì)于大鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的療效及其可能作用機(jī)制，為UC的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1對(duì)象

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠30只，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量(160±10)g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。 許可證號(hào):SCXK (京) 2014-0004。北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：No.114013000075657。質(zhì)量檢測(cè)單位為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。

1.1.2藥品和試劑 虎地腸溶膠囊(安徽九方制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20020035，規(guī)格0.4 g/粒)，純凈水稀釋，配置混懸液，按2.5 mg/g體重灌胃；4 %葡聚糖硫酸鈉(DSS)溶液(美國(guó)MP Biomedicals公司，批號(hào)216008120，分子量36 000～50 000)；兔抗大鼠多克隆TJP2(ZO2)抗體(貨號(hào)GTX12276，批號(hào)821904953)、兔抗大鼠多克隆Hsp70抗體(貨號(hào)GTX104126，批號(hào)43138)、兔抗鼠多克隆Occludin抗體(貨號(hào)GTX114949，批號(hào)43670)、兔抗大鼠多克隆Aquaporin 4抗體(貨號(hào)GTX133151，批號(hào)42640)。以上抗體均購(gòu)置于美國(guó)Gene Tex公司。通用二步法試劑盒(鼠/兔增強(qiáng)聚合物法檢測(cè)系統(tǒng))購(gòu)置于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。抗體稀釋液、DAB顯色試劑盒、EDTA抗原修復(fù)液、PBS磷酸鹽緩沖液(粉劑)均購(gòu)置于福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組 將30只SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為3組，分別為對(duì)照組、UC模型組、虎地腸溶膠囊治療組，每組各10只。

1.2.2造模方法 采用DSS飲水法誘導(dǎo)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型。隨機(jī)選取10只大鼠為對(duì)照組，給予自由飲水喂養(yǎng)7 d。余20只大鼠造模，給予自由飲用4 % DSS水溶液喂養(yǎng)7 d。造模第5 d，造模大鼠出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)減少、食量減少、出現(xiàn)稀溏血便等癥狀，表明造模成功。

1.2.3給藥方法 造模成功后，治療組大鼠給予虎地膠囊內(nèi)容物混懸液按2.5 mg/g的劑量灌胃，對(duì)照組及模型組大鼠給予同等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥25 d。

1.2.4樣本采集 末次給藥后禁食24 h，脫頸處死大鼠，進(jìn)行末次稱重，取肛門至結(jié)腸末端，福爾馬林液保存。

1.2.5觀測(cè)指標(biāo) (1)一般情況：從造模第一天起每日觀察記錄各組大鼠進(jìn)食飲水情況、精神狀況、體重、糞便性狀及糞便隱血情況，計(jì)算疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI=體重下降評(píng)分+大便性狀評(píng)分+隱血評(píng)分)，參考熊駿[7]等評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。(2)結(jié)腸組織病理學(xué)改變：實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，取各組大鼠結(jié)腸病變部位組織或距肛門口1.5 cm處組織進(jìn)行4 % 多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，記錄。(3)免疫組化檢測(cè):取各組大鼠結(jié)腸病變部位組織或距肛門口1.5 cm處組織進(jìn)行4 %多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片、烤片，免疫組化染色過程嚴(yán)格按照1.2中所述試劑盒說明書操作，AQP4、HSP70、Occlundin、ZO2抗體濃度均為1∶300，封片完成，顯微鏡下觀察，并進(jìn)行免疫組化評(píng)分，參考陳衛(wèi)[8]等評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1一般狀況 實(shí)驗(yàn)期間對(duì)照組大鼠精神佳，毛色光亮，食量正常，大便為硬質(zhì)橢球形，實(shí)驗(yàn)期間未出現(xiàn)稀溏血便。除對(duì)照組外，其余兩組大鼠均在飲用4 % DSS水溶液后出現(xiàn)毛色晦暗、不喜動(dòng)、食量減少、大便不成形等表現(xiàn)，幾乎所有造模大鼠均在飲用4 % DSS水溶液第4 d時(shí)出現(xiàn)稀溏血便，部分大鼠肛門口可見血便附著，表示造模成功。治療組大鼠在虎地治療后精神、食量、大便情況逐漸好轉(zhuǎn)，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)為硬質(zhì)橢球形便，隱血陰性。UC模型組大鼠毛色晦暗，精神差，進(jìn)食量少，稀溏血便持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)大便為松軟成形便，隱血陰性。如圖1所示，治療組大鼠大便隱血評(píng)分在實(shí)驗(yàn)第11 d(即虎地灌胃治療第4 d)時(shí)開始下降，實(shí)驗(yàn)第27 d評(píng)分降至0分，UC模型組大鼠實(shí)驗(yàn)第17 d時(shí)大便隱血評(píng)分開始下降，至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)評(píng)分為1分。

圖1 每日記錄各組大便隱血評(píng)分變化

2.2疾病活動(dòng)指數(shù) 造模結(jié)束后，模型組和治療組大鼠DAI均為4分，治療組DAI于灌胃第5 d時(shí)下降，且與模型組相比出現(xiàn)顯著差異(P<0.001，n=9),模型組DAI于灌胃第11 d下降，此后模型組與治療組相比無顯著差異(P=0.606，n=9)。結(jié)果如圖2、表1所示。

圖2 灌胃第1-11 d大鼠DAI變化(*P<0.001，#P=0.606)(n=9)

表1 灌胃期治療組、模型組之間DAI的差異性分析M(Q1，Q3)

2.3組織病理學(xué)變化 光鏡下觀察三組大鼠結(jié)腸組織病理切片，部分病理切片見圖3。結(jié)果如下：對(duì)照組大鼠結(jié)腸黏膜完整，腸腺整齊，黏膜無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠結(jié)腸黏膜失去完整性，腸腺排列混亂，伴有黏膜糜爛，可見杯狀細(xì)胞消失、隱窩結(jié)構(gòu)消失，部分出現(xiàn)隱窩膿腫，腸黏膜大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分結(jié)腸可見炎癥浸潤(rùn)至黏膜肌層；治療組大鼠結(jié)腸黏膜破壞程度較模型組輕，炎癥細(xì)胞較模型組少，炎癥局限于黏膜層。

圖3 各組大鼠結(jié)腸組織HE染色×100注：A對(duì)照組：黏膜連續(xù)，隱窩結(jié)構(gòu)完整；B治療組：黏膜、隱窩結(jié)構(gòu)較完整，少量炎癥細(xì)胞局限于黏膜層；C、D模型組：黏膜糜爛、隱窩結(jié)構(gòu)消失

2.4各組大鼠結(jié)腸AQP4、ZO-2、Occludin、HSP70表達(dá)情況 模型組大鼠結(jié)腸組織中AQP4、ZO-2、Occludin、HSP 70表達(dá)水平顯著降低，與對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.05，n=10)。與模型組相比，虎地治療組大鼠結(jié)腸組織中AQP4、ZO-2、Occludin、HSP 70表達(dá)水平上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，n=10)。見表2。

表2 各組大鼠結(jié)腸組織Occludin、ZO-2、AQP4、HSP 70表達(dá)情況

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)作為一種反復(fù)發(fā)作，病程遷延的消化道疾病，對(duì)患者的健康、生活均造成了嚴(yán)重的影響，在過去的幾十年里，越來越多的實(shí)驗(yàn)研究致力于解開UC發(fā)病的謎團(tuán)，關(guān)于UC發(fā)生發(fā)展的病理生理學(xué)途徑方面已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，目前認(rèn)為腸上皮屏障破壞、免疫相關(guān)的細(xì)胞因子失衡在UC的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要。

腸黏膜形成的一種選擇性屏障，保護(hù)宿主免受腔內(nèi)內(nèi)容物和微生物的侵襲，同時(shí)允許營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、離子和水的自由流動(dòng)，我們稱之為“腸上皮屏障”。 腸上皮屏障功能在維持腸道健康中起著舉足輕重的作用。當(dāng)上皮屏障的完整性受到破壞，會(huì)導(dǎo)致腸黏膜通透性增高，微生物、毒素、病原體和過敏原進(jìn)入黏膜組織和血液循環(huán)導(dǎo)致炎癥的發(fā)生。腸上皮屏障主要由上皮細(xì)胞緊密連接(TJ)蛋白組成，如ZO-2、occludin和claudins等。這些TJ蛋白在形成和維持細(xì)胞旁屏障方面起著重要作用，緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞與UC炎癥的啟動(dòng)和加速有關(guān)[9-10]。Kuo等[11]的實(shí)驗(yàn)顯示在UC患者結(jié)腸組織中，occludin表達(dá)減少，導(dǎo)致caspase-3下調(diào)，從而限制上皮細(xì)胞凋亡，破壞黏膜動(dòng)態(tài)平衡，并引起結(jié)腸炎。Chang等[12]研究表明與對(duì)照組相比，DSS處理組小鼠結(jié)腸組織occludin、ZO-2的表達(dá)均顯著減少。

水通道蛋白4(AQP 4)、熱休克蛋白70(HSP 70)作為兩種重要的保護(hù)性因子廣泛存在于全身各個(gè)組織臟器。水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)是一種跨膜通道蛋白，負(fù)責(zé)水和/或小分子溶質(zhì)跨細(xì)胞膜的高效、選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)在調(diào)節(jié)細(xì)胞的體積和細(xì)胞內(nèi)滲透壓中起著關(guān)鍵的作用[13]。Hardin JA等[5]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型中，AQP 4的表達(dá)在DSS直接刺激12-24 h后顯著降低，并在整個(gè)治療期間保持抑制狀態(tài)。熱休克蛋白的功能主要是在各種生理應(yīng)激條件下(如感染、缺血等)給予細(xì)胞保護(hù)，有著強(qiáng)大的抗炎作用，是機(jī)體關(guān)鍵抗炎分子之一[8-9]。腸道內(nèi)的熱休克蛋白以HSP 70為主。Barbatis C等[15]研究發(fā)現(xiàn)活動(dòng)期UC炎癥上皮HSP 70c表達(dá)下調(diào)。Ramakrishna等[14]免疫組化結(jié)果顯示，DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎大鼠腸上皮細(xì)胞HSP 70的染色強(qiáng)度較低。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示模型組大鼠結(jié)腸組織中ZO-2、Occludin、AQP 4、HSP 70表達(dá)均較對(duì)照組顯著降低，提示DSS可以導(dǎo)致大鼠上皮緊密連接結(jié)構(gòu)受損、腸上皮屏障功能缺陷、抗炎因子缺失導(dǎo)致結(jié)腸炎癥的發(fā)生。與此同時(shí)本實(shí)驗(yàn)中，虎地治療組大鼠一般情況、大便隱血情況、疾病活動(dòng)情況較模型組均有好轉(zhuǎn)，組織病理學(xué)結(jié)果顯示，治療組黏膜損傷及炎癥反應(yīng)程度較輕。經(jīng)虎地治療后，大鼠結(jié)腸組織中ZO-2、Occludin、AQP 4、HSP 70含量均有顯著增加。

綜上表明，虎地腸溶膠囊對(duì)改善實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠一般情況、大便隱血情況、疾病活動(dòng)情況、組織病理學(xué)表現(xiàn)等方面具有一定作用。因此，我們推測(cè)虎地腸溶膠囊治療UC的機(jī)制可能與增加AQP 4、HSP 70等腸黏膜保護(hù)性因子的表達(dá)對(duì)抗腸道炎癥反應(yīng)、增加腸上皮緊密連接蛋白修復(fù)受損的腸上皮屏障有關(guān)。