蒙艷，白漪，霍松

昆明醫(yī)科大學(xué)附屬紅河醫(yī)院，云南紅河661000

血管內(nèi)皮細(xì)胞（VECs）存在于血管內(nèi)層，是抗血栓形成和抗炎的重要屏障，在維持血管穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)血管運動和參與生命活動中發(fā)揮重要作用［1］。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙可導(dǎo)致血管損傷，血管穩(wěn)態(tài)失衡，最終導(dǎo)致動脈粥樣硬化、高血壓、冠心病等血管疾病的發(fā)生［2］。分泌型卷曲相關(guān)蛋白2（sFRP2）具有Wnt拮抗劑的作用，是一種分泌型的抗凋亡相關(guān)蛋白［3］。研究顯示，在心臟成纖維細(xì)胞中sFRP2 可激活Wnt/β-catenin信號通路，減輕心肌纖維化，從而改善心臟功能［4］。在血管生成模型中，sFRP2 可抑制缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，增加內(nèi)皮細(xì)胞遷移，從而誘導(dǎo)血管形成［5］。最近研究顯示，脂多糖（LPS）可刺激人支氣管上皮細(xì)胞中Wnt5a、β-catenin 表達升高，且Wnt抑制劑能抑制LPS 刺激引起的炎癥反應(yīng)［6］。目前，LPS 誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）凋亡已被廣泛用于研究內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的體外實驗?zāi)Ｐ?，但是sFRP2 對LPS 誘導(dǎo)HUVECs 凋亡的影響及其相關(guān)機制報道較少。為此，我們于2018 年5 月—2020 年1月進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：HUVECs 購自武漢普諾賽生命科技有限公司。質(zhì)粒：sFRP2 過表達及陰性對照慢病毒質(zhì)粒由上海吉凱基因科技有限公司構(gòu)建及包裝。主要試劑：TRIzol 試劑購自美國Thermo 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，qPCR試劑盒購自上海東洋紡生物科技有限公司；兔抗sFRP2、兔抗Bax、兔抗Bcl-2、兔抗Wnt1 均購自美國Abcam 公司，兔抗 Cyt C、兔抗 β-catenin 及 Cyclin D1均購自美國CST 公司，β-actin 購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，BCA 試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司。

1.2 LPS 作用濃度篩選 采用CCK-8 法。將HU?VECs 置于含 10%FBS 的 DMEM 高糖培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。調(diào)整HUVECs 細(xì)胞密度為5×105/mL，取100 μL 接種于96 孔培養(yǎng)板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 24 h。將 HUVECs 分為兩部分，一部分加入不同濃度 LPS（0、5、10、15、20μg/mL），另一部分作為對照細(xì)胞不予特殊處理，作用12 h。吸出原培養(yǎng)液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液100 μL 和CCK-8 溶液10 μL，培養(yǎng)箱中孵育3 h。使用酶標(biāo)儀讀取490 nm處的光密度（OD）值，每次實驗設(shè)置 3 個復(fù)孔。細(xì)胞存活指數(shù)=（OD待測孔-OD空白孔）/（OD對照孔-OD空白孔）。結(jié)果顯示，加入 0、5、10、15、20μg/mL LPS 作用 12 h 的 HUVECs 細(xì)胞存活指數(shù)分別為 0.78 ± 0.10、0.91 ± 0.05、0.66 ± 0.12、0.43 ±0.04、0.28 ± 0.03，對照細(xì)胞為1.08± 0.07；加入10、15、20μg/mL LPS作用12 h的HUVECs細(xì)胞存活指數(shù)明顯低于對照細(xì)胞（P均＜0.01），選擇10μg/mL LPS作用12 h作為后續(xù)實驗條件。

1.3 細(xì)胞分組及處理 取融合至70%～80%的HUVECs，以 1×106/孔接種至 6 孔板中，細(xì)胞貼壁18～24 h后分為過表達組和陰性對照組。過表達組和陰性對照組分別轉(zhuǎn)染sFRP2過表達及陰性對照慢病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48 h后加入10μg/mL LPS作用12 h。

1.4 細(xì)胞sFRP2 mRNA 表達檢測 采用實時熒光定量PCR 法。取兩組細(xì)胞，用冰冷的PBS 離心洗滌后去除上清，向沉淀中加入1 mL TRIzol 裂解液，提取細(xì)胞總RNA，測定RNA 濃度及純度合格后，將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA。以cDNA 作為模板，加入酶和引物進行PCR 反應(yīng)，每個樣本獨立重復(fù)檢測3次，每次設(shè)置3 個復(fù)孔。sFRP2 引物序列：上游引物5'-GAC?CATTTCTGCTCCGGGAT-3'，下游引物 5'-GGGGAT?GCAAACGTGCAAAA-3'。內(nèi)參GAPDH 引物序列：上游引物5'-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3'，下游引物5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'。采用2－ΔΔCt法計算sFRP2 mRNA相對表達量。

1.5 細(xì)胞sFRP2蛋白表達檢測 采用Western blot?ting 法。取兩組細(xì)胞，用冰冷的PBS 離心后冰上裂解20 min，BCA 試劑盒測定蛋白濃度。加入適量上樣緩沖液，金屬浴100 ℃煮沸5 min 使蛋白變性。定量40 μg 總蛋白，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行蛋白電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h 以上。分別加入sFRP2（1∶1 000）和內(nèi)參β-actin（1∶3 000）一抗，4 ℃孵育過夜；加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育1.5 h。TBST 洗膜，滴加ECL 化學(xué)發(fā)光底物，化學(xué)發(fā)光成像儀顯影拍照。以β-actin為內(nèi)參，采用Image J軟件分析條帶灰度值，計算sFRP2蛋白相對表達量。

1.6 細(xì)胞凋亡能力觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。取兩組細(xì)胞，用不含EDTA 的胰酶消化，預(yù)冷PBS 洗滌2次；1 500 r/min 離心 5 min，收集沉淀，加入 500 μL緩沖液重懸細(xì)胞，制成密度為5×108/L 的細(xì)胞懸液。分別加入5μL Annexin Ⅴ（綠色熒光）和PI（紅色熒光）染液，混勻后避光孵育15 min。使用流式細(xì)胞儀計算細(xì)胞凋亡率。

1.7 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達檢測 取兩組細(xì)胞，參照1.5采用Western blot?ting法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Cleaved Caspase-3、Bcl-2及Wnt/β-catenin 通路相關(guān)蛋白Cyclin D1、β-catenin（以上稀釋比例均為1∶1 000）、Wnt1（稀釋比例為1∶4 000）表達，β-actin為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graphpad7.0 和SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞sFRP2 表達比較 過表達組與陰性對照組sFRP2 mRNA 相對表達量分別為2.69 ±0.13、1.04 ± 0.21，蛋白相對表達量分別為 3.89 ±0.18、1.05± 0.24；兩組比較P均＜0.01。見圖1。

圖1 兩組細(xì)胞sFRP2蛋白表達條帶圖（Western boltting法）

2.2 兩組細(xì)胞凋亡率比較 過表達組與陰性對照組細(xì)胞凋亡率分別為13.32% ± 1.98%、20.90% ±1.72%，兩組比較P＜0.01。

2.3 兩組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及Wnt/β-catenin 通路相關(guān)蛋白表達比較 過表達組Cleaved Caspase-3、Bax及Wnt1、β-catenin、Cyclin D1表達均低于陰性對照組，Bcl-2表達高于陰性對照組（P均＜0.05）。見表1。

表1 兩組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達比較（±s）

表1 兩組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達比較（±s）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05。

組別過表達組陰性對照組Bax 2.14±0.03*4.13±0.03 Cleaved Caspase-3 2.66±0.04*3.24±0.06 Bcl-2 0.67±0.10*0.38±0.04 Wnt1 1.70±0.07*2.38±0.04 β-catenin 2.94±0.03*4.62±0.06 Cyclin D1 2.47±0.04*3.08±0.03

3 討論

分泌型卷曲相關(guān)蛋白（sFRP）家族包含5 個成員，在胚胎發(fā)生和腫瘤發(fā)生過程中具有重要作用［7］。sFRP2 是間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生的分泌蛋白，在增強間充質(zhì)干細(xì)胞抗凋亡能力和缺氧條件下的自我更新方面具有重要作用［8］。sFRP2 通常被認(rèn)為能夠?qū)nt配體與卷曲受體隔離開來，而事實上sFRP2 是賴氨酸去甲基化酶2A（KDM2A）的靶基因。在許多癌癥細(xì)胞中，sFRP2 啟動子高甲基化伴隨著Wnt 信號通路激活［9］。改善血管內(nèi)皮功能是治療動脈粥樣硬化、高血壓、冠心病等心血管疾病的關(guān)鍵。在體內(nèi)炎癥損傷狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞半滲透性屏障破壞，導(dǎo)致血管內(nèi)液體溢出、組織水腫和血栓形成，在這種狀態(tài)下也會發(fā)生細(xì)胞骨架損傷。LPS 是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要促炎分子之一，可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，使白細(xì)胞滲透血管壁，增加血管通透性［10］。內(nèi)皮細(xì)胞對LPS的反應(yīng)是呈Toll樣受體4（TLR4）依賴性的，可導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的后續(xù)釋放及黏附分子表達增加，進一步刺激炎癥級聯(lián)，嚴(yán)重時會引發(fā)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)綜合征［11-12］。本研究結(jié)果顯示，≥10 μg/mL的LPS可引起HUVECs 細(xì)胞存活指數(shù)明顯降低，因此選擇10 μg/mL LPS 作為后續(xù)實驗的作用濃度。本研究中過表達組sFRP2 mRNA和蛋白表達明顯高于陰性對照組，提示成功在HUVECs中過表達sFRP2基因；過表達組細(xì)胞凋亡率及促進細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白Bax 和Cleaved Caspase-3表達明顯低于陰性對照組，抑制細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白Bcl-2 表達明顯高于陰性對照組，提示過表達sFRP2 可減少LPS 誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞凋亡。

Wnt/β-catenin 通路在多細(xì)胞真核生物中高度保守，在細(xì)胞增殖、黏附等生理過程中具有至關(guān)重要的作用，并參與炎癥性疾病、纖維化疾病和多種癌癥的發(fā)生過程。Wnt通路組件的不恰當(dāng)激活發(fā)生于多種疾病的發(fā)病過程中，如Wnt1、Cyclin D1、β-catenin等。研究發(fā)現(xiàn)，LPS 刺激可使人支氣管上皮細(xì)胞中Wnt5a 和 β-catenin 表達升高，且 Wnt 抑制劑能抑制LPS 引起的人支氣管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)［6］。本研究結(jié)果顯示，過表達組Wnt1、β-catenin、Cyclin D1 表達均低于陰性對照組，提示sFRP2 抑制細(xì)胞凋亡的作用可能與其抑制Wnt/β-catenin通路有關(guān)。

綜上所述，過表達sFRP2 可減少LPS 誘導(dǎo)的HUVECs 細(xì)胞凋亡，其機制可能與抑制Wnt/β-catenin 信號通路有關(guān)，為改善血管內(nèi)皮損傷提供了新的治療靶點。