陳睿，馬騫，傅建芳，張婧，朱軍，王偉東，王旁

空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院，西安710032

阿霉素是治療腫瘤的常用藥，但會引起比較嚴重的心臟不良反應，導致其應用受到限制［1-2］。外泌體是細胞分泌的一種直徑為30～200 nm 的脂質雙分子膜結構囊泡，在多種疾病的發(fā)生和治療過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，間充質干細胞（MSCs）來源外泌體在治療炎癥和退行性疾病方面均具有良好療效［3］。骨髓間充質干細胞（BMSCs）來源外泌體被證實能夠減小心肌梗死面積，改善心功能［4］。脂肪間充質干細胞（mADSC）的生物學特性及免疫標志物與 BMSCs 基本相似［5］，因此，mADSC 來源外泌體可能發(fā)揮與BMSCs 外泌體相似的作用，但目前關于mADSC 來源外泌體對阿霉素所致心肌損傷的影響及其機制鮮有報道。為此，我們于2019 年2 月—2020年5月進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：雄性C57 小鼠30 只，6～8 周齡，均購自空軍軍醫(yī)大學動物實驗中心，于SPF條件下飼養(yǎng)，動物實驗操作均符合空軍軍醫(yī)大學動物實驗管理委員會制定標準。細胞：心肌細胞H9C2 購自陜西帆昌生物科技有限公司。主要試劑：阿霉素購自上海源葉生物科技有限公司；α-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、Ⅰ型膠原酶均購自美國Gibco 公司，雙抗購自美國Thermo Scientific 公司，外泌體提取試劑盒購自美國System Biosciences 公司，TUNEL檢測試劑盒購自杭州碧云天生物科技有限公司，DiI染料購自南京建成生物技術有限公司；外泌體表面標志物 CD81、TSG101、GAPDH 及高爾基體標記物GM130 均購自美國 CST 公司，mADSC 表面標志物CD29、CD90 和粒細胞表面標志物 CD34、CD45 抗體均購自英國Abcam公司；QIAQuick PCR純化試劑盒、miRNA qRT-PCR 試劑盒、miR-21a-5p 引物均購自廣州銳博生物技術有限公司。主要儀器：Western blot?ting 電泳儀及相關成像設備購自美國Bio-Rad 公司，激光共聚焦掃描系統(tǒng)購自日本Olympus 公司，Vevo 2100 超聲成像儀購自加拿大Visual Sonics 公司。

1.2 外泌體的提取、培養(yǎng)及鑒定

1.2.1 mADSC 的提取與培養(yǎng) 取雄性C57 小鼠3只，無菌條件下采集皮下脂肪組織，用眼科剪剪碎至糜狀，置于無菌離心管中。加入0.5%Ⅰ型膠原酶，避光消化45 min，加入等體積α-MEM 培養(yǎng)基終止消化。將上述混合物通過200 目無菌鋼篩過濾，收集過濾物于無菌離心管中，1 500 g 離心5 min、離心半徑13.5 cm。棄上清后加入等體積紅細胞裂解液，冰上裂解5 min。在4 ℃環(huán)境下離心后，加入α-MEM完全培養(yǎng)基，將細胞懸液鋪于培養(yǎng)皿中。24 h 后換液去除未貼壁細胞，待生長融合度達80%后，按照1∶2 比例進行傳代。光鏡下觀察顯示提取的細胞形態(tài)為長梭形，在脂肪誘導培養(yǎng)基中生長可誘導為脂肪細胞，油紅染色可見脂滴形成；在成骨誘導培養(yǎng)基中生長可誘導為骨細胞，茜素紅染色可見鈣結節(jié)；流式細胞術檢測結果顯示提取的細胞表面高表達CD29、CD90，不表達CD34、CD45（圖1）；提示成功獲取并培養(yǎng)mADSC。

1.2.2 mADSC來源外泌體的提取與鑒定 取3～4代mADSC，待其生長融合度達80%后，將完全培養(yǎng)基更換為無血清α-MEM 培養(yǎng)基，48 h 后收集細胞上清。按說明書加入適當體積的ExoQuick-TC 外泌體提取試劑，4 ℃條件下孵育過夜，1 500 g 離心30 min、離心半徑15 cm，分離外泌體。磷鎢酸染色后透射電鏡下顯示其為圓形或橢圓形，包膜完整（圖2）；粒徑分析技術檢測其直徑為30～220 nm（圖3），與 HESSVIK 等［6］檢測結果一致；Western blotting 法檢測結果顯示其表達TSG101、CD81、GAPDH 蛋白，不表達高爾基體相關蛋白GM130（圖4）；提示成功提取mADSC 來源外泌體。將分離后的外泌體后用1 mL無菌PBS溶解，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 提取細胞的表面標志物表達情況（流式細胞術）

圖2 mADSC來源外泌體形態(tài)鑒定結果（透射電鏡）

圖3 mADSC來源外泌體粒徑分析鑒定結果

圖4 mADSC來源外泌體表面標志物鑒定結果

1.2.3 血漿外泌體的提取與鑒定 取雄性C57 小鼠血漿1 mL，根據說明書加入適當體積ExoQuick-TC外泌體提取試劑，4 ℃條件孵育過夜，1 500 g離心30 min、離心半徑13.5 cm，參照1.2.2 的方法進行鑒定，證實為外泌體。

1.3 心肌細胞、心臟組織對mADSC 來源外泌體的攝取情況觀察 將mADSC 來源外泌體重懸于無菌PBS 中，加入 5 μmol/L DiI 孵育 10 min。洗滌 DiI 標記的外泌體，重懸于無菌PBS 中漂洗3 次，去除游離的DiI 和其他雜質。①心肌細胞攝取情況觀察：將H9C2細胞培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)孵箱中，使用DMEM+10%胎牛血清+1%雙抗進行培養(yǎng)。待生長融合度達80%后，按照1∶2比例傳代。將DiI標記的外泌體加入正常傳代培養(yǎng)的H9C2 細胞，并在無血清條件下以2μg/mL 工作濃度孵育3 h，倒置顯微鏡觀察顯示H9C2 細胞出現紅色熒光。②心臟組織攝取情況觀察：取C57 小鼠2 只，尾靜脈注射DiI標記的外泌體（1 μg/μL）20 μL，12 h 后取小鼠心臟進行冰凍切片，共聚焦顯微鏡觀察顯示小鼠心臟組織出現紅色熒光。以上結果提示，mADSC 來源外泌體可被H9C2細胞及小鼠心臟組織攝取。

1.4 mADSC 來源外泌體對阿霉素所致心肌細胞損傷影響的觀察

1.4.1 細胞分組處理 將H9C2細胞按1.3的方法培養(yǎng)于10 cm2培養(yǎng)皿中，待生長融合度達80%后，分為損傷1組、處理1組和對照1組。損傷1組、處理1組均加入無菌PBS稀釋的阿霉素（終濃度為1μmol/L），處理1組同時加入終濃度為2μg/mL的mADSC來源外泌體，對照1組加入等體積的PBS，作用24 h后收集細胞。

1.4.2 細胞凋亡能力觀察 ①TUNEL 染色法：取各組細胞爬片，4%多聚甲醛固定10 min 后，PBS 漂洗3 次。配置0.5% Triton 溶液，在細胞爬片中滴入適量體積 Triton 溶液，10 min 后用 PBS 漂洗 3 次。按說明書將TUNEL 染色試劑盒中的A、B 液進行混合，避光條件下將混合液滴加到細胞爬片上，37 ℃條件下孵育60 min。將細胞爬片用PBS 漂洗后，使用共聚焦顯微鏡觀察并對凋亡細胞進行計數。②流式細胞術：取各組細胞，消化后收集細胞，將1×105個細胞重懸于200μL Binding Buffer中。加入0.5 mg/mL PI溶 液 4 μL 和 Annexin V-FITC 溶 液 2 μL（Annexin V-FITC 最大激發(fā)光為488 nm、發(fā)射光為520 nm，PI最大激發(fā)光為535 nm、發(fā)射光為617 nm），室溫避光孵育15 min，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 mADSC 來源外泌體對阿霉素所致小鼠心肌損傷影響的觀察

1.5.1 阿霉素心肌損傷動物模型建立及分組處理 取雄性C57小鼠18只，隨機分為損傷2組、處理2 組和對照 2 組，每組 6 只。損傷 2 組與處理 2 組尾靜脈注射阿霉素10 mg/kg，處理2組同時尾靜脈注射mADSC來源外泌體20μL（濃度為1μg/μL），對照組尾靜脈注射等體積生理鹽水；1次/周，連續(xù)4周。

1.5.2 心肌組織細胞凋亡情況觀察 采用TUNEL染色法。各組處理4周后分別取3只小鼠，處死后取出心臟，用刀片單向切割成3～4 mm2大小的組織塊，進行常規(guī)固定、脫水透明、浸蠟、包埋，4～6 μm厚度切片。4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3次。參照1.4.2 采用TUNEL 染色對凋亡細胞進行計數，采用流式細胞術檢測細胞凋亡率。

1.5.3 心臟纖維化情況觀察 采用Masson 染色。將1.5.2 獲取的心臟切片脫蠟至水，Weiger 鐵蘇木素染5～10 min，PBS 漂洗后5.1%鹽酸乙醇分化；流水沖洗后麗春紅酸性品紅液染5～10 min，蒸餾水稍沖洗，1%磷鉬酸水溶液處理約5 min；苯胺藍液或綠液復染5 min，11.1%醋酸處理1 min，95%乙醇脫水多次；無水乙醇脫水，Xylenes 透明，中性樹膠封片。判讀結果，膠原纖維、黏液、軟骨染色呈藍色，細胞質、肌肉、纖維素、紅細胞染色呈紅色，細胞核染色呈藍黑色，記錄三組染色情況并計算膠原纖維占心臟面積的百分比，簡稱纖維化比例。

1.5.4 左心室射血分數（LVEF）測量 各組處理4周后分別取3 只小鼠，2.5%～3.0%異氟烷麻醉，使用配備有13～24 MHz傳感器的Vevo 2100超聲成像儀進行檢測，在乳頭肌中段水平進行二維短軸M 型超聲心動圖檢查，測量LVEF。

1.6 小鼠血漿外泌體與mADSC 來源外泌體中miR-21a-5p 表達檢測 采用實時熒光定量PCR 法。將血漿外泌體與mADSC 來源外泌體重懸于250μL PBS 中，并溶解于 750 μL TRIzol 試劑中，提取總RNA。在 RNA 沉淀過程中添加 GlycoBlue 5 μL，通過Agilent 2100 生物分析儀測量總RNA。使用QIA?Quick PCR 純化試劑盒（Qiagen）進行純化，miRNA qRT-PCR試劑盒檢測miR-21a-5p表達。

1.7 miR-21a-5p 作用靶點的 GO 功能、KEGG 通路富 集 分 析 利 用“clusterProfiler”“enrichplot”“gg?plot2”軟件包進行基因本體（GO）功能和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。GO 功能富集分析主要包括生物學過程（BP）、細胞組分（CC）和分子功能（MF），基于GO 數據庫進行顯著性分析。KEGG 通路富集分析是依據KEGG 數據庫對差異的基因進行通路顯著性分析。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0、R3.63 軟件和GraphPad Prism7 統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較和組內比較分別采用成組t檢驗和配對t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 損傷1組、處理1組和對照1組細胞凋亡情況比較 損傷1組、處理1組和對照1組細胞凋亡數和細胞凋亡率均逐漸降低，組間兩兩比較P均＜0.05。見表1。

表1 各組細胞凋亡數及凋亡率比較（±s）

表1 各組細胞凋亡數及凋亡率比較（±s）

注：與對照1組比較，*P＜0.05；與處理1組比較，#P＜0.05。

組別損傷1組處理1組對照1組細胞凋亡數（個）103±5*#44±4*13±3細胞凋亡率（%）23.2±0.1*#8.6±0.3*2.2±0.2

2.2 損傷2 組、處理2 組和對照2 組小鼠心肌組織細胞凋亡情況比較 損傷2 組、處理2 組和對照2組小鼠心肌組織細胞凋亡數和細胞凋亡率均依次降低，組間兩兩比較P均＜0.05。見表2。

表2 損傷2組、處理2組和對照2組小鼠心肌組織細胞凋亡數及凋亡率比較（-x± s）

2.3 損傷2 組、處理2 組和對照2 組小鼠心臟纖維化情況、LVEF 比較 損傷2 組、處理2 組和對照2組小鼠心肌組織纖維化比例依次降低、LVEF 依次升高，組間兩兩比較P均＜0.05。見表3。

表3 損傷2組、處理2組和對照2組小鼠心肌組織纖維化比例及LVEF比較（%，±s）

表3 損傷2組、處理2組和對照2組小鼠心肌組織纖維化比例及LVEF比較（%，±s）

注：與對照2組比較，*P＜0.05；與處理2組比較，#P＜0.05。

組別損傷2組處理2組對照2組n 6 6 6纖維化比例11.5±3.2*#5.1±0.3*2.3±0.1 LVEF 0.39±0.04*#0.60±0.03*0.79±0.03

2.4 小鼠血漿外泌體與mADSC來源外泌體中miR-21a-5p表達比較 小鼠血漿外泌體與mADSC來源外泌體中miR-21a-5p 相對表達量分別為1.05±0.01、5.41± 0.05，二者比較P＜0.05。

2.5 miR-21a-5p 的 GO 功能、KEGG 通路富集分析結果 GO 功能分析結果顯示，miR-21a-5p主要富集在輸尿管芽形成、泛素結合酶復合物、突觸囊泡聚集、竇房結細胞與心房肌細胞的通訊、回旋處連接、核糖體拆卸、回旋處大亞基結合、肺形態(tài)發(fā)生因子參與的上皮細胞增殖調控、rDNA 連接、K6 相關蛋白泛素化等通路。KEGG 通路富集分析結果顯示，miR-21a-5p 可調控多種信號通路，如DNA 損傷修復、mTOR 信號通路、血管平滑肌舒張相關信號通路、脂肪酸代謝相關通路等。

3 討論

阿霉素是蒽環(huán)類藥物的代表性藥物，也是治療多種癌癥的首選藥物之一，但其臨床應用受到劑量依賴性以及延遲性心臟毒性的限制。阿霉素導致的心臟損傷往往為不可逆性心肌損傷，主要表現為惡性心律失常、擴張性心肌病、心功能不全以及心力衰竭等［1-2］。阿霉素引起心肌損傷機制極為復雜，其主要機制包括：①阿霉素與NADH 脫氫酶和細胞色素P-450 還原酶發(fā)生氧化還原反應，產生大量活性氧（ROS），ROS 蓄積導致心肌損傷［7-8］；②阿霉素與DNA 相互作用，并抑制拓撲異構酶Ⅱβ（Top2β）生成，從而抑制DNA 解旋，并最終阻止蛋白質合成，從而導致心肌細胞凋亡［9］；③阿霉素可引起心肌細胞中鐵代謝異常，導致心肌細胞中線粒體DNA 損傷，從而導致心肌細胞凋亡［10］。盡管關于阿霉素導致心肌損傷的分子機制研究較多，但相關靶點藥物及治療策略仍未在臨床上進行推廣使用。因此，探究一種新型心肌保護策略對于減輕阿霉素所致心肌損傷至關重要。

既往研究表明，MSCs 是一種多能祖細胞，可以通過誘導心肌細胞分化、組織修復、抗炎和免疫抑制等多種機制來減輕動物心肌損傷和改善患者心臟功能［11-12］。但是，宿主移植的MSC 生存率低，只有一小部分移植MSC 在其可能的靶組織中存活，這極大地限制了MSC的臨床應用。盡管存在這些限制，但細胞具有旁分泌作用，移植后存活的MSC在某些情況下仍能正常工作。MSC可以分泌大量生長因子、細胞因子和趨化因子，這些因子可以促進心肌細胞增殖、減少細胞凋亡、改善缺血性微環(huán)境并動員內源性心臟干細胞［13］。同樣，MSC可以通過分泌外泌體來調節(jié)靶細胞的生物學功能。既往研究表明，BMSCs來源外泌體可促進心肌缺血模型中的心肌細胞存活并延緩心肌結構重塑［13］。但 BMSCs 獲取困難，增殖能力較弱，而mADSC則容易獲取且其增殖能力強于BMSCs。

外泌體功能的發(fā)揮需要細胞和組織的攝取，從而釋放活性物質，對相應靶點進行干預。為使得外泌體的攝取功能可視化，首先需要對外泌體進行標記。DiI是一種親脂性的熒光染料，可以用來對細胞膜和其他脂溶性生物結構染色，常用于外泌體標記。當被綠光激發(fā)并結合到細胞膜中時，DiI會發(fā)出強紅色熒光，并且不會破壞膜的特性。本研究結果顯示，小鼠mADSC來源外泌體可以減輕阿霉素所致H9C2細胞和小鼠心肌細胞凋亡，減輕阿霉素所致小鼠的心肌纖維化及心功能下降。

miR-21a-5p 是一種心臟保護性miRNA，而外泌體中富含miRNA，因此本研究檢測了小鼠血漿外泌體與干細胞外泌體中miR-21a-5p 表達情況，驗證干細胞外泌體是否通過增加miR-21a-5p 表達來保護心臟。本研究結果顯示，mADSC 來源外泌體miR-21a-5p 表達顯著高于血漿外泌體，推測mADSC 來源外泌體通過升高miR-21a-5p 表達而發(fā)揮心肌保護作用。利用GO 數據庫可以得到目標基因在CC、MF 和BP 三個層面上主要和哪些分子功能和生物過程有關。本研究結果顯示，miR-21a-5p 可調控多種信號通路，如DNA 損傷修復、mTOR 信號通路、血管平滑肌舒張相關信號通路、脂肪酸代謝相關通路等，這提示mADSC 來源外泌體可升高miR-21a-5p表達并通過調控多種信號轉導通路來保護心肌。此外，mADSC 來源外泌體中核酸及蛋白含量豐富，其他蛋白、miRNA 及IncRNA 是否在阿霉素所致的心臟損傷中發(fā)揮保護作用尚未可知。因此，mAD?SC 來源外泌體中的其他成分還有待進一步檢測及研究。

綜上所述，mADSC 來源外泌體可減少阿霉素所致心肌細胞凋亡，減輕阿霉素所致小鼠心肌纖維化并提高其心功能，其機制可能與升高miR-21a-5p 表達進而調控多種信號通路有關。盡管mADSC來源外泌體能夠發(fā)揮心肌保護作用，但其在臨床上的應用還面臨重大挑戰(zhàn)。外泌體通過不同注射途徑注射進入小鼠后的主要富集器官各不相同，靜脈注射外泌體主要富集于肝臟、脾臟以及肺臟，而腹腔注射外泌體主要富集于腹腔臟器［14］。由于心臟內血流速度快且單核吞噬細胞含量較低，故外泌體在心臟內的濃度較低，低劑量外泌體無法起到應有的保護作用，而增加外泌體濃度則無法排除其對肝臟、脾臟等其他器官的影響［15］。因此，如何提高外泌體在心臟內的富集濃度是解決外泌體治療心臟疾病的關鍵問題。