孫乙，王惠，于騰飛，朱艷，朱玉廣

1 濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261053；2 濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院

后囊膜混濁（PCO）是白內(nèi)障術(shù)后最常見的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響了患者的視覺質(zhì)量，目前尚無有效的治療藥物［1-3］。研究發(fā)現(xiàn)，PCO 主要是由于白內(nèi)障術(shù)后殘留的晶狀體上皮細(xì)胞（HLECs）發(fā)生過度增殖、移行并分化而導(dǎo)致的［4］。在正常情況下HLECs位于富氧的晶狀體前部，而白內(nèi)障手術(shù)后HLECs 移動到晶狀體后部的缺氧微環(huán)境中，并開始增殖、轉(zhuǎn)分化過程［5］。E-cadherin 和 α-SMA 是上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)志性蛋白，通過檢測E-cadherin 和α-SMA 表達(dá)可以評估上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的程度［6］。研究證實，在缺氧微環(huán)境下，缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）發(fā)揮著重要作用，并參與啟動 HLECs 的轉(zhuǎn)分化［7］。2019 年8 月—2020 年 4 月，本研究觀察了 HIF-1α 基因沉默對缺氧誘導(dǎo)HLECs 轉(zhuǎn)分化的影響，為明確PCO 發(fā)生的分子生物學(xué)機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：HLEC-B3 細(xì)胞株購于上海復(fù)蒙公司。主要試劑：DMEM 培養(yǎng)液、TRIzol 試劑（美國Gibco 公司），胎牛血清（澳大利亞Hyclone 公司），Power SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒（美國ABI公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time RNA 提取試劑盒（上海生工生物工程有限公司），兔抗人HIF-1α、E-cadherin 單克隆抗體（美國Santa Cruz 公司），兔抗人α-SMA 單克隆抗體（美國CST 公司），F(xiàn)ITC 標(biāo)記羊抗兔二抗、山羊抗兔IgG（上海生工生物工程有限公司），siRNA Control、HIF-1α siRNA 質(zhì)粒（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen 公司）。質(zhì)粒：HIF-1α siRNA 委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成，HIF-1α siRNA的有效序列為5′-GUGAUGAAAUUCCGAAUTT-3′，并經(jīng)過mRNA 有效性檢測，陰性siRNA 不會引起基因序列變化。

1.2 HLEC-B3 培養(yǎng)及傳代 快速解凍液氮保存的HLEC-B3，加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，吹打混勻后培養(yǎng)。3～4 d 更換1 次DMEM 培養(yǎng)液。待HLEC-B3 融合度達(dá)90%時，胰酶消化傳代。選擇傳至3代的HLEC-B3進行實驗。

1.3 細(xì)胞分組與處理 取處于對數(shù)生長期的HLEC-B3，隨機分為常氧對照組、缺氧對照組、陰性siRNA缺氧組和HIF-1α siRNA缺氧組，胰酶消化，培養(yǎng)24 h后去培養(yǎng)液。缺氧對照組、陰性siRNA缺氧組和HIF-1α siRNA缺氧組加入終濃度為100μmol/L的CoCl2溶液，37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)進行缺氧培養(yǎng)24 h。陰性siRNA缺氧組和HIF-1α siRNA缺氧組缺氧處理24 h，采用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染陰性siRNA 和HIF-1α siRNA，轉(zhuǎn)染24 h后進行后續(xù)檢測。

1.4 細(xì)胞HIF-1α、E-cadherin 及α-SMA mRNA 表達(dá)檢測 采用實時熒光定量PCR 法。取各組細(xì)胞，采用TRIzol 試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板進行PCR 反應(yīng)。PCR 引物序列由上海生工生物工程有限公司設(shè)計合成，見表1。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，58 ℃退火30 s，74 ℃延伸30 s，共39 個循環(huán)；最后58 ℃作用30 s。采用 2－ΔΔCt法計算各組細(xì)胞 HIF-1α、E-cadherin 及 α-SMA mRNA相對表達(dá)量。

表1 HIF-1α、E-cadherin、α-SMA及內(nèi)參GAPDH引物序列、引物長度

1.5 細(xì)胞HIF-1α、E-cadherin及α-SMA蛋白表達(dá) 采用Western blotting 法。取各組細(xì)胞，胰酶消化，加入RIPA 裂解液充分裂解，蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA protein assay reagent 檢測蛋白濃度。按體積比為4∶1 加入上樣緩沖液，水浴變性，進行SDSPAGE電泳。采用濕轉(zhuǎn)法蛋白轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，分別加入兔抗人HIF-1α、E-cadherin及α-SMA單克隆抗體（稀釋比例分別為1∶600、1∶800、1∶500），4 ℃孵育過夜。洗膜后加入二抗，室溫孵育2 h。再次PBS-T 洗膜，取 ECL 試劑盒中 A 液 0.5 mL、B 液 0.5 mL，加入PVDF 膜，避光反應(yīng)15 min，曝光掃描。采用Image-Pro Plus 圖像軟件分析條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，計算HIF-1α、E-cadherin 及α-SMA 蛋白相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以-x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞HIF-1α、E-cadherin 及α-SMA mRNA表達(dá)比較 與常氧對照組比較，缺氧對照組、陰性siRNA 缺氧組HIF-1α mRNA 相對表達(dá)量均升高，HIF-1α siRNA缺氧組HIF-1α mRNA相對表達(dá)量降低（P均＜0.05）。與常氧對照組比較，缺氧對照組、陰性siRNA 缺氧組E-cadherin mRNA 相對表達(dá)量均降低、α-SMA mRNA相對表達(dá)量均升高（P均＜0.05）。與缺氧對照組、陰性siRNA缺氧組比較，HIF-1α siRNA缺氧組E-cadherin mRNA 相對表達(dá)量升高、α-SMA mRNA相對表達(dá)量降低（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組細(xì)胞HIF-1α、E-cadherin及α-SMA mRNA表達(dá)比較（-x± s）

2.2 各組細(xì)胞HIF-1α、E-cadherin 及α-SMA 蛋白表達(dá)比較 與常氧對照組比較，缺氧對照組、陰性siR?NA 缺氧組 HIF-1α 蛋白相對表達(dá)量均升高，HIF-1α siRNA 缺氧組 HIF-1α 蛋白相對表達(dá)量降低（P均＜0.05）。與常氧對照組比較，缺氧對照組、陰性siRNA 缺氧組E-cadherin 蛋白相對表達(dá)量均降低、α-SMA 蛋白相對表達(dá)量均升高（P均＜0.05）。與缺氧對照組、陰性siRNA 缺氧組比較，HIF-1α siRNA缺氧組E-cadherin 蛋白相對表達(dá)量升高、α-SMA 蛋白相對表達(dá)量降低（P均＜0.05）。見表3、圖1。

表3 各組細(xì)胞HIF-1α、E-cadherin及α-SMA蛋白表達(dá)比較（-x± s）

3 討論

圖1 各組細(xì)胞HIF-1α、α-SMA、E-cadherin蛋白表達(dá)條帶圖（Western blotting法）

白內(nèi)障目前是我國發(fā)病率最高的致盲性眼病，主要治療方法是白內(nèi)障超聲乳化聯(lián)合人工晶體植入術(shù)，而對于屈光性白內(nèi)障手術(shù)來說，PCO是高端人工晶體植入術(shù)后視覺干擾的主要原因之一［8-11］。在生理狀態(tài)下，與眼睛中的其他組織相比，晶狀體缺乏有氧呼吸［7］。晶狀體前部主要從房水中吸收氧氣，而晶狀體后部的氧氣由玻璃體供應(yīng)［12］。房水中的氧張力比玻璃體中的氧張力高很多，因此晶狀體前部處于富氧環(huán)境，后部則處于缺氧環(huán)境［13-14］。在正常情況下HLECs 位于富氧的晶狀體前部，而白內(nèi)障術(shù)后晶狀體囊袋內(nèi)殘留的富氧環(huán)境中的HLECs 移動到晶狀體后部缺氧微環(huán)境中，在缺氧、炎癥因子等刺激下，HLECs 在數(shù)小時內(nèi)開始增殖、遷移和轉(zhuǎn)分化過程［4，11］。因此，抑制 HLECs 增殖、遷移、轉(zhuǎn)分化是一種預(yù)防PCO 的有效方法。本研究對HLECs 進行100 μmol/L CoCl2處理，建立HLECs 缺氧模型，以模擬體內(nèi)HLECs的缺氧微環(huán)境［5，15］。

在缺氧微環(huán)境中，術(shù)后殘存的HLECs 通過多種方式適應(yīng)缺氧微環(huán)境，其中缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）發(fā)揮著中心介導(dǎo)作用［5，7］。HIF-1 蛋白由 α 和 β 兩個亞單位組成，其中HIF-1α 亞單位被認(rèn)為是特異性氧調(diào)節(jié)亞單位，決定了HIF-l 的活性。研究發(fā)現(xiàn)，活化的HIF-l 可與靶基因上的HIF-l 結(jié)合位點結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，從而啟動靶基因轉(zhuǎn)錄，使機體適應(yīng)缺氧環(huán)境［16］。因此，本研究以HIF-1α 為靶點進行了HIF-1α 基因沉默實驗。本研究結(jié)果顯示，與常氧對照組比較，缺氧對照組、陰性siRNA 缺氧組HIF-1α mRNA 及蛋白相對表達(dá)量均升高，證實缺氧可以誘導(dǎo) HLECs 的 HIF-1α 表達(dá)增加，而 HIF-1α siRNA 缺氧組HIF-1α mRNA 及蛋白相對表達(dá)量均低于其他各組，證實成功沉默HIF-1α基因表達(dá)。

HLECs 轉(zhuǎn)分化是指上皮細(xì)胞的極性改變，失去已分化的上皮細(xì)胞表型，出現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞的表型改變，使HLECs 獲得遷移、浸潤能力。轉(zhuǎn)分化的特征性改變是介導(dǎo)細(xì)胞黏附屬性的黏附因子E-cadherin 表達(dá)下調(diào)或消失，代表肌成纖維細(xì)胞的α-SMA 表達(dá)增加。白內(nèi)障術(shù)后殘存的HLECs 轉(zhuǎn)分化，形成大量細(xì)胞外基質(zhì)，包括纖維蛋白、糖蛋白及各種膠原蛋白纖維沉積于后囊膜上，使后囊膜皺縮，導(dǎo)致PCO 的形成，最終影響患者的視功能［17］。本研究結(jié)果顯示，與常氧對照組比較，缺氧對照組、陰性siRNA 缺氧組E-cadherin mRNA 及蛋白相對表達(dá)量均降低、α-SMA mRNA及蛋白相對表達(dá)量均升高，說明缺氧環(huán)境會誘導(dǎo)HLECs 轉(zhuǎn)分化；與缺氧對照組、陰 性 siRNA 缺 氧 組 比 較 ，HIF-1α siRNA 缺 氧 組E-cadherin mRNA 相對表達(dá)量升高、α-SMA mRNA相對表達(dá)量降低，說明沉默HIF-1α 基因表達(dá)可以抑制缺氧誘導(dǎo)的HLECs轉(zhuǎn)分化，證實HIF-1α參與了缺氧誘導(dǎo)的HLECs 轉(zhuǎn)分化過程，對于減少PCO 的發(fā)生具有重要意義。

綜上所述，HIF-1α 基因沉默可以抑制缺氧誘導(dǎo)的HLECs 發(fā)生轉(zhuǎn)分化，為白內(nèi)障術(shù)后PCO 的防治提供了新靶點，也為臨床了解白內(nèi)障術(shù)后PCO 的發(fā)生及發(fā)展提供了新思路。