高敏，職利琴 ，吳倩，郭洪兆

1 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西咸陽712046；2 西安市第五醫(yī)院

病毒性心肌炎（VMC）是指感染病毒之后引起的，以心肌非特異性炎癥為主要病變的心血管系統(tǒng)疾病，好發(fā)于年輕人群，被認(rèn)為是青少年群體發(fā)生心力衰竭、心律失常和猝死的一個重要原因［1］。目前，臨床上針對VMC 的治療以抗病毒治療和營養(yǎng)心肌為主，但療效并不樂觀。單純的西醫(yī)治療容易使病毒產(chǎn)生耐藥性，有研究在西醫(yī)基礎(chǔ)上聯(lián)合使用中藥治療VMC，結(jié)果顯示可有效改善患者癥狀，提高其免疫力、降低復(fù)發(fā)風(fēng)險［2-3］。芪歸八味湯以當(dāng)歸補(bǔ)血湯和生脈散為基礎(chǔ)方，主要由黃芪、當(dāng)歸、太子參、麥冬、五味子、柏子仁、天冬、紅花八味藥組成，主治氣陰兩虛型VMC。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是由英國藥理學(xué)家HOPKINS［4］首次提出的，主要是以系統(tǒng)生物學(xué)和生物信息學(xué)為基礎(chǔ)，全面分析藥物與疾病和靶點之間的“多成分、多靶點、多途徑”協(xié)同作用關(guān)系。2019年10 月—2020 年9 月，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析芪歸八味湯治療VMC的作用機(jī)制?，F(xiàn)報告如下。

1 方法

1.1 藥物活性成分篩選與靶點預(yù)測 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp. php）數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)ADME 參數(shù)設(shè)置口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為篩選條件，收集芪歸八味湯中各中藥的化學(xué)成分及其作用靶點。因TCMSP 數(shù)據(jù)庫中未收錄麥冬，在中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具（BATMAN-TCM）數(shù)據(jù)庫中獲得麥冬的化學(xué)成分，設(shè)置“藥物—靶點”模型的相似性閾值≥20、P≤0.05，選取符合條件的活性成分。選擇UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）的UniProtKB 搜索功能，將靶蛋白轉(zhuǎn)換為對應(yīng)的靶基因，得到所有靶基因的官方名稱。將得到的靶點信息進(jìn)行統(tǒng)計整理，利用Cytoscape3.7.2 軟件以8 味中藥篩選后的化學(xué)成分與標(biāo)準(zhǔn)化的基因名稱為基礎(chǔ)，根據(jù)Degree 值大小依次排列，繪制藥物—成分—靶點關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 藥物—疾病共同靶點獲取 在OMIM 數(shù)據(jù)庫（http：//omim. org/）和 Genecards 數(shù)據(jù)庫，以“Viral myocarditis”為檢索詞，收集VMC 的疾病相關(guān)靶點。將去重后的疾病靶點與藥物靶點通過R軟件繪制韋恩圖，獲得藥物—疾病共同靶點。

1.3 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選 將關(guān)鍵靶點輸入String 數(shù)據(jù)庫（https：//stringdb. org/），研究物種設(shè)置為Homo sapiens，置信度設(shè)置為0.9，隱藏游離的節(jié)點，獲得可視化關(guān)于藥物—疾病共同靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，并導(dǎo)出TSV 文件。將PPI 網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入 Cytoscape3.7.2，通過 Network Ana?lyzer 進(jìn)行分析，將平均 Degree 值為 8.870 4、平均緊密度為0.427 0、平均介度為0.014 9作為標(biāo)準(zhǔn)，三項均高于上述標(biāo)準(zhǔn)的靶點即為芪歸八味湯治療VMC的核心靶點。

1.4 核心靶點的基因本體（GO）功能和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 將芪歸八味湯治療VMC 的核心靶點進(jìn)行GO 功能和KEGG通路分析，設(shè)置P＜0.01。按照每個條目涉及的靶點數(shù)目進(jìn)行排序，根據(jù)P值大小列出前20 條路徑，篩選排名靠前的生物過程和通路。

2 結(jié)果

2.1 活性成分篩選結(jié)果 TCMSP 數(shù)據(jù)庫對芪歸八味湯中7 味中藥的活性成分進(jìn)行檢索，結(jié)果顯示共收集 616 種成分（黃芪 87 種、當(dāng)歸125 種、太子參 25種、五味子130種、天冬32種、柏子仁28種、紅花189種），篩選并刪除無靶點的成分后得到42 種有效成分（黃芪16種、當(dāng)歸2種、太子參5種、五味子7種、天冬 7 種、柏子仁 5 種、紅花 16 種）；BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果顯示麥冬的有效成分共18種。其中，太子參、紅花、天冬和當(dāng)歸的重復(fù)成分為β-谷甾醇，太子參和紅花的重復(fù)成分為木犀草素，紅花和黃芪的重復(fù)成分為山柰酚，紅花、黃芪和天冬的重復(fù)成分為槲皮素，紅花、當(dāng)歸、天冬和麥冬的重復(fù)成分為豆甾醇。8 味中藥共對應(yīng)有效基因靶點1 252 個，剔除重復(fù)靶點后最終獲得479個藥物靶點。

2.2 藥物—成分—靶點關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖繪制結(jié)果 藥物—成分—靶點關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖包括552個節(jié)點（藥物8個、成分 66 個、靶點479 個）和1 706 條邊。成分按Degree 值大小排名前10 位分別為槲皮素（448）、豆甾醇（210）、β-谷甾醇（140）、山柰酚（115）、木犀草素（112）、尿苷（44）、花生四烯酸（38）、7-O-methyliso?mucronulatol（38）、pseudoprotodioscin_qt（38）、鳥 嘌呤核苷（38），靶點按Degree 值大小排名前10 位分別為 PTGS2（41）、NCOA2（37）、PTGS1（31）、PRSS1（22）、PGR（20）、AR（20）、GABRA1（20）、DPP4（18）、SCN5A（17）、ADRB2（17）。

2.3 藥物—疾病共同靶點獲取 將OMIM 和Gene?cards 數(shù)據(jù)庫的VMC 相關(guān)靶點匯總，刪除重復(fù)靶點后得到1 058個疾病靶點，與479個藥物靶點取交集，得到124個藥物—疾病共同靶點。

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及核心靶點篩選結(jié)果 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖包括124 個節(jié)點、479 條邊，篩選出的核心靶點有19 個，分別為腫瘤壞死因子（TNF）、JUN、RELA、AKT1、MAPK1/8/14、白細(xì)胞介素（IL）-4/6、TP53、CXCL8、EGFR、FOS、VEGFA、CASP8、EGF、CTNNB1和EDN1。見表1。

表1 芪歸八味湯治療VMC的核心靶點信息

2.5 核心靶點的GO 功能富集分析結(jié)果 GO 功能富集分析得到2 739 個條目，在生物學(xué)過程（BP）中富集2 502 條路徑，主要參與對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、外源性凋亡信號通路等過程；在細(xì)胞成分（CC）中富集92條路徑，主要涉及薄膜筏、膜微域、膜區(qū)域等部位；在分子功能（MF）中富集145 條路徑，主要涉及受體配體活動、細(xì)胞因子受體結(jié)合等方面。

2.6 核心靶點的KEGG通路富集分析結(jié)果 KEGG通路富集分析得到164 條通路途經(jīng)，富集排名靠前的通路主要有糖尿病并發(fā)癥中的AGE/RAGE 信號通路（靶點數(shù)目32）、TNF 信號通路（靶點數(shù)目29）、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化信號通路（靶點數(shù)目30）、乙型肝炎（靶點數(shù)目31）、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染信號通路（靶點數(shù)目32）、南美錐蟲?。ò悬c數(shù)目26）、IL-17 信號通路（靶點數(shù)目27）、人巨細(xì)胞病毒感染（靶點數(shù)目30）、MAPK信號通路（靶點數(shù)目30）、丙型肝炎（靶點數(shù)目26）、甲型流感（靶點數(shù)目26）、人類免疫缺陷病毒1 感染（靶點數(shù)目25）、細(xì)胞凋亡（靶點數(shù)目24）等。

3 討論

VMC 根據(jù)臨床癥狀劃屬于“溫病”“心悸”“胸痹”“怔忡”等范疇。因患者體質(zhì)虛弱，又復(fù)感溫?zé)岵⌒?，溫毒之邪犯及心脈發(fā)為本病。該病病位在心，涉及脾、肺、腎等臟器，屬本虛標(biāo)實之證［5］。目前臨床藥物治療策略大多是抗氧化、營養(yǎng)心肌、抗病毒等，但效果并不理想。芪歸八味湯是筆者導(dǎo)師多年的臨床經(jīng)驗總結(jié)，由當(dāng)歸補(bǔ)血湯和生脈散為基礎(chǔ)方加減，主治氣陰兩虛型VMC，共八味藥。黃芪、當(dāng)歸補(bǔ)氣養(yǎng)血，太子參、麥冬和五味子滋陰止汗、益氣復(fù)脈，柏子仁和天冬滋心陰、安心神，紅花調(diào)和諸藥、通暢血運。研究表明，黃芪皂苷可以顯著抑制炎癥因子IL-1β、TNF-α 等表達(dá)，太子參多糖可抑制心肌細(xì)胞凋亡，麥冬改善心肌缺血，五味子能減少炎癥反應(yīng)對心肌的損害，紅花強(qiáng)心，天冬降壓、減慢心率，柏子仁營養(yǎng)心?。?］。因此，芪歸八味湯全方八味中藥對心血管系統(tǒng)有不同的保護(hù)作用。

本研究通過對藥物—成分—靶點網(wǎng)絡(luò)圖分析可知，芪歸八味湯主要的化學(xué)成分是槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素等。研究表明，槲皮素具有抗病毒、抗炎、清除活性氧自由基等作用，可通過降低 VMC 小鼠 TGF-β1和 TNF-α 表達(dá)抑制 NF-κB通路的激活［7-9］。豆甾醇可顯著抑制 TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達(dá)，并通過下調(diào)NF-κB p65 和p38 MAPK，增加 IL-10 釋放［10］。JINA 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇具有抗炎作用，可減少IL-1、TNF-α 等炎癥因子釋放。木犀草素可以減輕炎癥反應(yīng)，并通過調(diào)節(jié)NF-κB 和MAPK 信號通路來緩解氧化應(yīng)激［12］。由此可見，芪歸八味湯的化學(xué)成分主要通過抗炎以及降低氧化應(yīng)激來治療VMC。

本研究PPI 結(jié)果顯示，芪歸八味湯作用于VMC的 核 心 靶 點 主 要 是 TNF、JUN、RELA、AKT1、MAPK1/8/14、IL-4/6、TP53、CXCL8、EGFR、FOS、VEGFA、CASP8、EGF、CTNNB1 和 EDN1。TNF 是一類促炎因子，而VMC 的心肌病變可能與TNF-α 有關(guān)，高水平的TNF-α 會對心肌造成損傷；此外，TNF-α 還可以激活NF-κB 信號通路，進(jìn)而促進(jìn)炎癥因子分泌［13］。JUN 主要參與細(xì)胞增殖、免疫相關(guān)以及凋亡抑制等信號通路［14］。AKT 是 PI3K/AKT 信號通路中的核心橋梁點，參與炎癥過程、心血管疾病等的發(fā)生發(fā)展［15-16］；此外，AKT 可以促進(jìn) CASP 磷酸化，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡［17］。鞏子漢等［18］發(fā)現(xiàn)，MAPK1 不僅可以正向調(diào)控TNF-α 表達(dá)，還可以和MAPK14 共同參與炎癥反應(yīng)過程。由此可見，芪歸八味湯可通過多個靶點治療VMC。

本研究KEGG 富集分析結(jié)果顯示，排名靠前的通路有糖尿病并發(fā)癥中的AGE/RAGE 信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染信號通路、乙型肝炎、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化信號通路、人巨細(xì)胞病毒感染、MAPK 信號通路、TNF 通路、細(xì)胞凋亡、IL-17 信號通路等。TNF通路主要促進(jìn)TNF-α、IL-6、IL-8 等炎癥因子釋放，加重機(jī)體的炎癥反應(yīng)［19］。IL-17信號通路是一條經(jīng)典的促炎通路，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)過程［20］。MAPK 信號通路涉及細(xì)胞生長、增殖和凋亡等功能［21］。楊超茅等［22］發(fā)現(xiàn)，AGE/RAGE 信號通路可以激活NADPH 氧化酶，繼而活化NF-κB，從而釋放大量 TNF-α、IL-1 等炎癥因子。TNF 通路和IL-17信號通路與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，提示芪歸八味湯可能主要作用于炎癥因子來抑制炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮治療VMC的作用。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法系統(tǒng)研究了芪歸八味湯治療VMC 的作用機(jī)制，表明芪歸八味湯中的活性成分可通過調(diào)節(jié)AGE/RAGE、MAPK、TNF、IL-17信號通路等，減輕炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮治療VMC 的作用，證實了中藥復(fù)方多靶點、多途徑、協(xié)調(diào)治療疾病的過程。