黃曉春(綜述)，賴彥華(審校)

捐獻器官保存雖已過去幾十年，但在肝臟保存領(lǐng)域的研究卻進展較慢[1]。然而，近年來使用越來越多的擴大標準供體(extended criteria donor,ECD)供肝卻使體外機械灌注(machine perfusion，MP)技術(shù)重新進入了移植學者們的視野。MP這個概念最早可追溯到20世紀30年代，由Carrel和Lindbergh[2]提出。1968年，Belzer等[3]及Starzl等[4]先后報道了低溫MP在人類肝腎保存中的應用。20世紀70～80年代Collins液、UW液(the University of Wisconsin solution)等器官保存液的發(fā)明應用，靜態(tài)冷保存(static cold storage，SCS)隨之成為了器官保存的首選方式，取代了當時笨重的MP設備，減輕了對MP需求的迫切性[5]。隨著供體器官短缺問題日益突出，擴大供體池的一個策略就是應用ECD[6,7]。這類供體器官術(shù)后早期移植物功能不全(early allograft dysfunction，EAD)、原發(fā)性無功能(primary nonfunction，PNF)及膽道病變等并發(fā)癥明顯增多[8,9]。傳統(tǒng)保存方式已經(jīng)無法滿足器官保存的需要，MP技術(shù)再次成為研究熱點[10,11]。動物實驗[12～15]證實，MP可減輕線粒體的損傷，改善供肝的內(nèi)皮細胞功能，有效保護膽管及膽管上皮細胞及維持大鼠重度脂肪變性肝臟的形態(tài)學結(jié)構(gòu)。根據(jù)灌注過程中維持溫度不同，MP可劃分為低溫機械灌注(hypothermic machine perfusion,HMP)、亞常溫機械灌注(subnormothermic machine perfusion,SNMP)及常溫機械灌注(normothermic machine perfusion，NMP),其對應溫度分別為0～10 ℃、20～30 ℃、32～38 ℃[16,17]。但MP同時還受壓力、灌注時間、氧合情況等參數(shù)綜合影響。近年來MP在臨床供肝保存中的應用取得了一些令人矚目的新進展，本文擬對此進行綜述。

1 HMP

HMP是目前最為成熟的MP方案，已在腎移植領(lǐng)域廣泛應用[10,18,19]。HMP僅用冰塊即可實現(xiàn)預期溫度，一旦MP設備失?；蛘呷藶椴僮魇д`，離體器官仍可以在低溫下得到妥善保存[11,20]。同時在低溫條件下氧耗明顯下降，可以不需要攜氧載體或其他能量物質(zhì)，所以在灌注液的選擇上空間更大。另外，低溫條件下病原體生長緩慢，移植物相關(guān)感染亦減少。但這也同時限制了對離體肝臟功能狀態(tài)的評估，特別是無法評估膽汁的生成狀況[16,20]。HMP可單獨通過門靜脈或雙灌注(門靜脈和肝動脈)進行。積極的氧合作用在心臟死亡器官捐獻(donation after cardic death，DCD)供肝和脂肪肝中都有一定的改善作用，但并不是必需[21～23]。在目前的臨床實踐中，大多數(shù)中心采用雙灌注、低溫攜氧灌注(hypothermic oxygenated perfusion,HOPE)或兩者皆有。灌注方法的多樣性與低溫條件下肝臟代謝需求的減少有關(guān)。2010年Guarrera等[23]首次報道了20例標準腦死亡(donation after brain death，DBD)人類供肝使用未攜氧低溫雙灌注的臨床研究。結(jié)果提示，與SCS組相比，HMP組EAD發(fā)生率、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)平均峰值更低，住院天數(shù)亦更少。在隨后的5年里，該研究團隊進行了一項針對臨床肝臟MP保存的經(jīng)過匹配的隊列研究。HMP應用在邊緣性DBD器官后，術(shù)后膽道并發(fā)癥發(fā)病率HMP組顯著低于SCS組(4% vs 13%，P=0.016)[24]。Dutkowski等[21]則首次證實了MP對于DCD供肝的保護作用。在這項研究中，DCD供肝首先經(jīng)過SCS處理，隨后經(jīng)門靜脈進行低溫攜氧MP，故這項方案也被稱為HOPE方案。這項研究證實經(jīng)過MP保存后DCD供體在肝臟功能、腎臟功能及術(shù)后并發(fā)癥方面都與DBD供體具有可比性。雖然還缺乏進一步大樣本的臨床隨機對照試驗，但這項研究對于ECD的應用意義重大。此外，Schlegel教授在2017年國際肝移植學會年會上作會議報告指出，50例接受HOPE的DCD供肝移植后，治療組5年移植物存活率為94%，未治療組為78%(P=0.024)，其與標準DBD供肝并無顯著差異[25]。這是第一個經(jīng)HOPE方案治療的中期生存結(jié)果報告，也是目前為止例數(shù)最多的臨床試驗報告。同時，現(xiàn)有3項分別旨在評估HMP與SCS對ECD-DBD、DBD、DCD移植物效果的Ⅱ期或者Ⅲ期多中心臨床隨機對照試驗已經(jīng)結(jié)束，目前尚未見相關(guān)結(jié)果發(fā)表[25]。

2 SNMP

SNMP是一種介于低溫與常溫之間的灌注方式，環(huán)境溫度設定為20～30 ℃。與HMP相比，SNMP在保存過程中可以維持組織代謝，因此可以對離體的供肝進行功能評估[14]。與NMP相比，不需要復雜的控溫、控氧裝置[26,27]。盡管與其他兩種灌注方式相比有其獨特優(yōu)勢，但目前臨床進展較HMP及NMP滯后，關(guān)于SNMP的應用報道還局限于動物實驗和人類廢棄的肝臟中。還需進一步加大研究力度，進行臨床試驗來評價其功能。Bruinsma等[28]于2014年首次報道了亞常溫下(21 ℃)攜氧MP在人類供肝中的應用，這也是目前為止SNMP應用于人類供肝的唯一報道。7例人類棄用供肝灌注3 h后，發(fā)現(xiàn)隨著攝氧量的提升，pH值于開始的20 min內(nèi)下降，但在2 h后恢復正常，乳酸水平在灌注過程中也恢復正常。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)水平在20 min內(nèi)顯著增加，之后維持穩(wěn)定。尿素、白蛋白產(chǎn)生穩(wěn)定，腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)含量隨灌注時間穩(wěn)定增加，組織學檢查顯示肝臟內(nèi)皮細胞無明顯損傷。膽汁在生成量及質(zhì)量方面表現(xiàn)良好。研究結(jié)果顯示，SNMP能有效地維持甚至改善肝膽功能相關(guān)指標。但遺憾的是，該報道中的7例棄用供肝均未應用于移植受體，故無移植后的臨床數(shù)據(jù)來進一步支撐灌注效果。這是未來SNMP臨床試驗里必不可少的重要一環(huán)?？刂菩詳y氧復溫(controlled oxygenated rewarming，COR)是近年來對MP在溫度調(diào)控方面提出的一個重要舉措。實驗結(jié)果[29]表明，突然的溫度變化(即由低溫保存直接過渡到亞低溫或者常溫)即使在充分氧化的情況下亦容易造成線粒體失功。而COR則可避免熱休克損傷，通過緩慢提高代謝活動進而改善移植物功能[30]。Hoyer等[31]于2016年首次報道了COR在臨床上的應用，驗證了COR在肝臟保存中的可行性及安全性。6例棄用供肝在純氧狀態(tài)下接受灌注，由10 ℃開始每隔15 min提升4 ℃直至20 ℃，共用時90 min。6例受體接受此類肝臟移植后均未發(fā)生EAD，峰值A(chǔ)ST及國際標準化比值均低于同期單純冷保存對照組，移植物6個月的生存率亦高于對照組(100% vs 80.9%，P=0.24)。該團隊目前正在進行一項單中心臨床隨機對照預試驗[25]，進一步擴大樣本量，以比較COR與SCS在缺血再灌注損傷方面的效果。該試驗已于2019年年底結(jié)束，尚未見相關(guān)報道。至于復溫的最佳溫度，目前只有動物實驗報道，尚無臨床研究。

3 NMP

NMP是一種基于模擬正常體溫(37 ℃)狀態(tài)下進行肝臟灌注保存的方式，旨在提供一種近似生理的環(huán)境，以維持正常的肝功能，避免冷缺血性損傷。通過對血流動力學指標、生化參數(shù)和合成功能來評估移植物活力[32,33]。目前這項技術(shù)在臨床嘗試應用最為積極。但NMP在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性，需雙重灌注、攜氧載體、營養(yǎng)補充及溫度控制裝置來全面支持肝臟功能。一旦灌注設備失效，器官將有完全暴露于熱缺血狀態(tài)的風險。所以NMP在灌注過程中需密切關(guān)注機械運轉(zhuǎn)狀況，以及時發(fā)現(xiàn)故障并處理[34,35]。目前NMP在臨床上已陸續(xù)有研究報道。op den Dries等[32]于2013年首次報道經(jīng)常溫灌注后被臨床棄用供肝的研究，證實了NMP對DCD肝臟的修復作用及其臨床可行性。隸屬于歐洲器官保護聯(lián)盟(the Consortium for Organ Preservation in Europe，COPE)的牛津大學團隊于同年在ScienceDaily上報道了首次經(jīng)NMP后成功肝移植的案例[36]。該中心利用常溫灌注了24 h的肝臟進行臨床移植，患者術(shù)后恢復較好。該實驗意義在于提示NMP對延長肝臟保存時限有積極作用。隨后該團隊于2016年報道了一組臨床Ⅰ期試驗結(jié)果，證明了NMP應用在DBD和DCD移植物的安全性與可行性[37]。與對照組相比，NMP組的供肝AST峰值水平顯著降低，且移植后EAD發(fā)生率較低，無受體出現(xiàn)缺血性膽管病。該研究還通過血流動力學、代謝和合成功能的檢測，證實了NMP的可行性。臨床Ⅲ期試驗結(jié)果證實NMP可顯著減少供肝棄用率(50%)并改善移植受者術(shù)后肝功能[38]。該臨床試驗發(fā)表的系列結(jié)果，包括長期隨訪數(shù)據(jù)，或?qū)⑹谴_定NMP在肝移植圍手術(shù)期中臨床應用的重要依據(jù)。Selzner等[39]和Bral等[40]也相繼完成了臨床Ⅰ期的NMP試驗。這兩項研究都初步證實了NMP的安全性和可行性，臨床效果與SCS具有可比性。值得注意的是，Bral指出，在一個案例中，由于插管過程中出現(xiàn)了一個操作者未能識別的錯誤，導致灌注被迫中止，肝臟最終被棄用。該學者由此強調(diào)NMP的技術(shù)復雜性，并建議NMP操作人員需經(jīng)過特定的培訓，以更為安全有效地使用機械設備。目前還有2個多中心、Ⅲ期隨機對照試驗以比較NMP和SCS保存移植物效果為目的的臨床試驗正在進行，均預計于2020年結(jié)束[25]。亦有學者在獲取后先行SCS一段時間，待移植物轉(zhuǎn)運至受體所在醫(yī)院后再進行NMP，即終端缺血性常溫機械灌注(end-ischemic NMP)[41]。Watson等[42]報道了連續(xù)12個被臨床棄用的供肝應用end-ischemic NMP的情況，其中灌注前冷缺血時間平均為427 min(222～877 min)。11例患者順利出院，隨訪時間平均為12個月，其中3例出現(xiàn)了缺血性膽管病。研究者認為，即使經(jīng)過NMP灌注治療，盡量減少冷缺血時間仍是挽救邊緣供肝的有效措施；同時應避免高濃度氧氣灌注，以減少再灌注后綜合征(post-reperfusion syndrome，PRS)和血管痙攣的發(fā)生。de Vries等[43]于2019年首次報道了序貫性HOPE-COR-NMP臨床方案，嘗試將不同溫度下MP的優(yōu)勢結(jié)合起來。7例臨床棄用的DCD來源供肝，經(jīng)過上述灌注方案處理后，其中5例供肝產(chǎn)生的膽汁pH>7.45。這5例供肝用于人體移植后，在中位(197 d，IQR 152～307 d)隨訪期內(nèi)無一例出現(xiàn)缺血性膽道疾病征象。因此研究者團隊認為，序貫性HOPE-COR-NMP灌注方案是供肝MP的一種新方法，雖然目前仍需要更長的隨訪時間觀察，但是安全可行的。上述試驗仍難以避免一定程度的冷缺血經(jīng)過。2017年中山大學何曉順團隊報道了全球首例無缺血器官移植(ischemia-free organ transplantation，IFOT)案例[44]。該團隊利用NMP技術(shù)，在供肝獲取、體外保存以及供肝植入過程中持續(xù)地為供肝提供血液和氧氣機器共運轉(zhuǎn)了270 min，銜接過程中未發(fā)生技術(shù)性問題。灌注期間的結(jié)果提示了NMP的有效性及良好的肝臟評估能力。進一步結(jié)果顯示，供肝獲取前、NMP保存后及復流后肝細胞凋亡沒有明顯增加。IL-β、TNF-α、IL-6及vWF在灌注全程亦沒有明顯的陽性表達，提示沒有明顯的炎癥因子釋放和肝竇內(nèi)皮細胞激活。受體于術(shù)后第17天順利康復出院。截至投稿前，該患者仍健康存活，無缺血性膽道病、急性排斥反應等移植肝并發(fā)癥存在。該案例意義在于，無缺血器官灌注技術(shù)的發(fā)明應用，有望結(jié)束器官移植的冷保存時代。同時有望延伸至所有的實體器官移植中，顯著改善移植器官的早期、長期預后，并使邊緣性器官得到最大化的利用。

4 結(jié)語

隨著公民逝世后器官捐獻工作的開展，如何評估供肝活性和提高其質(zhì)量是移植前的兩個主要問題。MP為我們提供了一個集診斷、評估預后，甚至包括個性化器官治療的平臺。由此，在移植前我們將由以往單一通過SCS抑制移植物代謝和功能轉(zhuǎn)變?yōu)橥ㄟ^MP提供代謝支持和動態(tài)評估移植物活性兩大類方法并存的局面。對于器官修復來說，一些令人興奮的方法是將基于MP的基因治療和間充質(zhì)干細胞加入到灌注液中[45,46]，以便在移植前修復受損的器官，達成在灌注過程中對移植物進行高度針對性的治療目的。同時引入生物活性物質(zhì)和調(diào)節(jié)免疫反應等干預治療的臨床研究結(jié)果亦令人對器官修復的前景充滿期待[47,48]。