顏啟璋，陳海波，路 瑩，曹 勇，溫文勝，于大海

研究發(fā)現(xiàn)人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus,HPV)與口咽癌尤其扁桃體鱗狀細胞癌(tonsil squamous cell carcinoma,TSCC)密切相關，且該種HPV相關性口咽癌有特殊的臨床生物學特點，如早期淋巴結轉移但預后較好[1，2]。國外研究[2，3]顯示，這種口咽癌發(fā)生與性生活習慣有關，但隨著國內外生活習慣的趨近，近來該疾病在國內的發(fā)病率也呈上升趨勢。細胞角蛋白7(cytokeratin 7,CK7)是單層和柱狀上皮的標志物，通常不表達于正常的鱗狀上皮細胞，而特異性地表達在子宮頸和口咽(扁桃體)組織上皮的交界處[4]。細胞角蛋白19(cytokeratin 19,CK19)在復層鱗狀上皮的基底細胞層中正常表達，目前被認為是癌前病變和口腔鱗癌等癌癥的易感性標志物[5，6]。CK7和CK19上調與HPV感染所致的宮頸癌和口咽癌密切相關[4，5]。p16INK4a蛋白(p16)是直接作用于細胞周期、抑制細胞分裂的抑癌蛋白，p16蛋白在正常細胞中表達水平較低，但在許多HPV相關的宮頸癌以及口咽癌中均高表達，為公認的HPV感染替代標志物[7～9]。研究[10]表明，在HPV相關性口咽癌中，HPV的致癌活性主要與E7蛋白在腫瘤細胞中的表達有關，而E7可結合視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma，Rb)抑癌蛋白并促進其降解，導致細胞周期失控，p16蛋白大量表達。雖然目前對于CK7、CK19和p16在口咽癌致癌機制中的作用以及它們相互的時空影響及其表達規(guī)律尚不清楚，但有研究[11，12]認為，在這個過程中CK7和CK19的參與起了重要的作用。關于三者在口咽癌中表達關系的研究仍較少，尤其是他們在相同部位表達關系的比較，以及癌組織、癌周隱窩上皮和表面上皮表達的比較更是鮮見報道。由于口咽包括扁桃體及軟腭等部位，為了減少混雜因素，本研究僅選取腭扁桃體鱗狀細胞癌病例，通過連續(xù)石蠟切片，選取3～5個視野觀察比較CK7、CK19和p16在同一部位的表達關系，探討其與HPV相關性扁桃體癌變機制的關系。

1 對象與方法

1.1研究對象 選擇2015-07～2018-01廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科收治的17例TSCC患者的病歷資料及組織樣本，其中男12例，女5例；年齡39～77歲；漢族13例，壯族4例；病程1～48月。病理診斷分別為高分化鱗癌7例，中高分化鱗癌3例，中分化鱗癌5例，中低分化鱗癌1例，低分化鱗癌1例。納入標準：(1)病理標本確診為腭扁桃體鱗狀細胞癌；(2)病案資料詳細完整；(3)具有完整的石蠟標本進行連續(xù)切片的檢測。排除標準：(1)臨床診斷與術后病理不一致者；(2)合并多種慢性疾病者；(3)既往有TSCC及其他惡性腫瘤病史。石蠟標本來自廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科，每個病例的石蠟標本取5 μm連續(xù)石蠟切片7～8張，可以在同一視野中比較CK7、CK19和p16的表達關系，能更好地反映表達的時空變化。

1.2主要試劑 一抗：p16(MAB-0673鼠單抗)、CK7(Kit-0021鼠單抗)和CK19(Kit-0030鼠單抗)的即用型抗體試劑均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。二抗：即用型快速免疫組化MaxVision HRP鼠/兔試劑盒(Kit-5010)購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司?？乖迯鸵海篢ris-EDTA抗原修復液(10×，pH=9.0；FD8804)購自杭州弗德生物科技有限公司。DAB顯色液：DAB顯色試劑盒(20×；ZLI-9018)購自北京中衫金橋生物技術公司。

1.3HE染色及免疫組化染色 所有標本取4張連續(xù)石蠟切片進行常規(guī)HE染色以及p16、CK7和CK19免疫組化染色。連續(xù)石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精復水后，采用Tris-EDTA行抗原修復，滴加3%過氧化氫去除內源性過氧化物酶，經(jīng)PBS緩沖液洗滌，先后滴加一抗及二抗孵育，DAB顯色后蘇木素復染，梯度酒精脫水，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4結果判斷 p16、CK7和CK19的陽性染色是指組織切片中目標細胞的胞核/胞質見黃色或棕黃色著色，且無背景染色。通過染色細胞百分率測定CK7和CK19的免疫反應性。陽性細胞百分率分級[13]：陰性細胞(<1%)，以“-”示；斑片染色(1%～40%)，以“+”示；彌漫染色(>40%)，以“++”示。根據(jù)中國及美國的診斷規(guī)范[14，15]將p16免疫組織化學檢測示≥70%的腫瘤細胞核和細胞質中等至強陽性但未行HPV DNA/RNA檢測的鱗狀細胞癌定義為HPV相關性(p16+)鱗狀細胞癌，故本研究將p16染色細胞百分率分級定為：陰性細胞(<1%)，以“-”示；斑片染色(1%～70%)，以“+”示；彌漫染色(>70%)，以“++”示。本研究以p16呈彌漫染色(>70%)作為判定HPV相關性(p16+)TSCC的標準。

1.5統(tǒng)計學方法 應用SPSS25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以例數(shù)(n)表示，采用Kappa一致性檢驗分析p16、CK7和CK19檢測結果的一致性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.117例TSCC癌組織及癌周正常上皮CK7、CK19和p16的免疫組化染色檢測結果 CK7、CK19、p16陽性染色均見于鱗癌細胞胞質。在11例CK7+中，僅1例呈彌漫染色(++)，10例呈斑片染色(+)。在15例CK19+中，有9例呈彌漫染色(++)，6例呈斑片染色(+)。在8例p16+中，有5例呈彌漫染色(++)，3例呈斑片染色(+)。除了CK7、CK19和p16三者同時陽性的病例外，檢測還發(fā)現(xiàn)了CK7-CK19+p16+的病例2例；未見單獨CK7+的病例，或者是CK7+和p16+而CK19-的病例，但有CK7+伴CK19+而p16-的病例。在p16強陽性(++)的病例中，皆伴隨CK19強陽性(++)。本研究的17例TSCC患者共有5例為HPV相關性(p16+)鱗狀細胞癌，另12例為非HPV相關性鱗狀細胞癌。見表1，圖1，2。

2.2HPV相關性(p16+)TSCC組織CK7、CK19、p16檢測結果的Kappa一致性分析結果 由于HPV相關性(p16+)TSCC樣本量較小(5例)，故分析選取了20個視野(每個樣本選4個視野)進行分析。Kappa一致性分析結果顯示，CK7與CK19、CK7與p16以及CK19與p16的檢測結果均具有一致性(P<0.05)。見表2。

表1 17例TSCC癌組織及癌周正常上皮CK7、CK19和p16的免疫組化染色檢測結果

?HE染色；?免疫組化染色見CK7在癌組織中尤其是癌巢內表面呈彌漫染色(++，黑箭頭示)，在隱窩上皮呈陰性(白箭頭示)；?免疫組化染色見CK19在癌組織(黑箭頭示)和隱窩上皮(白箭頭所示)均呈彌漫染色(++)；?免疫組化染色見p16在癌組織(黑箭頭所示)和隱窩上皮(白箭頭所示)均呈彌漫染色(++)

?HE染色；?免疫組化染色見CK7主要表達于上皮表層，呈斑片染色(+，黑箭頭示)；?免疫組化染色見CK19主要表達于上皮下層和基底細胞，呈斑片染色(+，黑箭頭示)；?免疫組化染色見p16主要表達于上皮下1/3至全層，呈斑片染色(+),與CK19部位基本重疊(黑箭頭示)

表2 HPV相關性(p16+)TSCC組織CK7、CK19、p16檢測結果的Kappa一致性分析結果(n)

2.3非HPV相關性TSCC組織CK7、CK19、p16檢測結果的Kappa一致性分析結果 對于非HPV相關性TSCC組織，Kappa一致性分析結果顯示，CK7與CK19、CK7與p16以及CK19與p16的檢測結果不具一致性(P>0.05)。見表3。

表3 非HPV相關性TSCC組織CK7、CK19、p16檢測結果的Kappa一致性分析結果(n)

2.417例TSCC癌周表面上皮組織CK7、CK19、p16檢測結果的Kappa一致性分析結果 對于TSCC癌周表面上皮組織，Kappa一致性分析結果顯示，CK7與CK19、CK7與p16以及CK19與p16的檢測結果均具有一致性(P<0.05)，其中以CK19與p16的檢測結果一致性最強。見表4。

表4 17例TSCC癌周表面上皮組織CK7、CK19、p16檢測結果的Kappa一致性分析結果(n)

2.517例TSCC癌周隱窩上皮組織CK7、CK19、p16檢測結果的Kappa一致性分析結果 對于TSCC癌周隱窩上皮組織，CK7與CK19、CK7與p16以及CK19與p16的檢測結果均具有一致性(P<0.05)，且一致性均較強。見表5。

表5 17例TSCC癌周隱窩上皮組織CK7、CK19、p16檢測結果的Kappa一致性分析結果(n)

3 討論

3.1E7是HPV相關口咽癌的主導性癌蛋白，CK7氨基酸91-96序列中的SEQIKA片段可與E7 mRNA結合，防止其降解，在角蛋白家族中只有CK7和E7有這種特異性的反應。而CK7特異性地表達于連接部位，如宮頸連接處上皮及扁桃體隱窩上皮。HPV感染機體后CK7可與E7 mRNA結合并鎖定其轉錄，而CK19作為CK7的異源二聚體，通過與CK7 SEQIKA片段結合，解除鎖定并促進E7 mRNA翻譯成癌蛋白[4，11，12，16]。E7與Rb抑癌蛋白結合并使之被降解，而Rb抑癌蛋白的失活解除了對p16轉錄的抑制，造成p16過度表達[10]。在HPV感染過程中，CK7和CK19調控E7、p16的表達機制仍未明確，認為CK7和CK19在參與調控E7的過程，可能存在一種“CK7→CK19→p16軸”的關系，但其是否存在嚴格的時間順序在臨床病理研究中尚未得到闡釋。

3.2本研究通過連續(xù)切片研究發(fā)現(xiàn)，無論在癌組織還是在癌周正常上皮中，除了CK7+CK19+p16+以外，還存在CK7+CK19+p16-或CK7-CK19+p16+的情況，但未出現(xiàn)CK7+CK19-p16+的情況。且統(tǒng)計學結果顯示，在癌周正常上皮和癌組織中，CK7、CK19和p16具有關聯(lián)性，提示可能存在“CK7→CK19→p16軸”的調控機制。本研究結果中的CK7+CK19+p16-可能是由于CK7與CK19的配對屬性造成的[13]，故二者能同時表達，而p16-說明該例TSCC可能并不是由HPV感染引起的癌變。另一方面，Huang等[17]發(fā)現(xiàn)，在宮頸上皮低度惡性病變中，CK7的表達是向惡性轉化的標志，而p16的表達與之無關。另外，Hashiguchi等[18]發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌中，隨著病情的進展，CK7的表達消失可預示宮頸癌的進展及預后不良。Woods等[4]發(fā)現(xiàn)在扁桃體隱窩上皮CK7特異性強陽性表達，而扁桃體癌中也發(fā)現(xiàn)CK7-和p16+的現(xiàn)象，認為是因為CK7隨著腫瘤進展和細胞分化而失去表達。Lee等[13]在宮頸癌變過程中的研究也發(fā)現(xiàn)，隨著癌變進展，CK7在癌前病變階段高表達，且隨著癌變進展，在癌時卻有近1/3的病例呈CK7-CK19+p16+的情況。說明CK7的表達可能是HPV感染的一個“早期事件”和先決條件，隨著病情的進展，CK7表達會逐漸消退，而p16的表達與CK19密切相關，是在HPV感染致癌過程中出現(xiàn)的“后期事件”。其中CK19可能起到了承上啟下的重要作用。

3.3本研究發(fā)現(xiàn)，在TSCC癌周正常表面上皮及隱窩上皮均有CK7、CK19及p16的表達。CK7主要表達于上皮表層，CK19主要表達于上皮下層及基底部，而p16主要在上皮的下1/3至全層表達，與CK19部位基本重疊。統(tǒng)計學結果也顯示，在癌周正常上皮中，CK7、CK19和p16具有關聯(lián)性，且CK19和p16的表達具有顯著一致性。Lee等[13]的研究結果也發(fā)現(xiàn)，在宮頸上皮內瘤變時，可觀察到上皮表層CK7和基底CK19的同時表達，隨著惡變的進展，CK7逐漸向下層擴展；而CK19的表達逐漸向上，且伴p16的表達，部位與之重疊，認為這是由于受到不同或復合的高危HPV感染，上皮表層來自鱗狀-柱狀上皮交界處的CK7+細胞和下層CK19+基底干細胞同時發(fā)生腫瘤轉化。而Woods等[4]發(fā)現(xiàn)，CK7表達于正常扁桃體以及TSCC癌周的隱窩上皮表層，但在表面上皮中未見表達，認為HPV感染引起的癌變應該來源于隱窩上皮而且是上皮表層，而不是深層。因此推測CK7需要CK19的參與才會進一步導致p16的表達。雖然本研究還發(fā)現(xiàn)了CK7、CK19和p16同時強陽性表達的病例，但這種強陽性表達可能正處于癌癥內表達達到峰值的時間點，隨后CK7逐漸消退。因此我們仍然認為CK7的表達需要CK19的參與才會引起癌變，如果沒有CK19對E7 mRNA翻譯的促進作用，CK7將無法引起p16的表達。

3.4另外，Klingenberg等[19]在262例非腫瘤扁桃體組織的研究發(fā)現(xiàn)，扁桃體隱窩以及表面上皮全部為p16-。而本研究針對扁桃體癌不僅在隱窩上皮中觀察到了類似的情況，也觀察到癌周的扁桃體表面上皮也有相似的表達，這說明在扁桃體受HPV感染引起癌變的情況下，可能表面上皮逆向地受到了癌組織HPV感染，這也符合高危型HPV可以感染暴露的基底細胞向鱗狀上皮分化后向上分裂和遷移的觀點[13]，或者癌組織的CK19和p16的表達可以反向誘導上皮表達CK19和p16。此外，由于CK7可表達于多種有分泌能力的細胞，因此，在上皮表層以及癌巢內表面的CK7陽性細胞還具有分泌釋放病毒的能力，有助于感染播散，而其表達降低則抑制了這種能力，這也許是機體組織的一種防御機制[13]。

3.5本研究還存在一些不足之處，雖然本課題組對所有樣本均進行了HPV-DNA的原位雜交檢測，而實驗結果均為HPV-DNA陰性，這可能與HPV-DNA原位雜交的敏感度較低有關，這與臨床上采用相同的方法所得的結果相類似[20]，當然也可能與實驗操作中的疏忽或樣本量較少有一定關系。由于p16的過表達在HPV驅動腫瘤細胞的存活中發(fā)揮重要作用，從而突出了p16免疫組化染色作為HPV陽性的替代指標的適用性[20]。因此本研究參照國內外的診斷規(guī)范采用p16作為HPV感染的替代標志物[14，15]。

綜上所述，CK7、CK19和p16在HPV相關性(p16+)TSCC中的表達可能存在“CK7→CK19→p16軸”的調控機制。但是，在這個過程中，CK7和CK19所起的作用仍未明確，例如CK7表達消退是癌變進展的必需，還是僅為癌變的后果；CK7在隱窩上皮的特異表達，是不是HPV感染導致癌變所必需，在其他CK7不表達的部位是否就不會發(fā)生癌變；或者是否還有其他因子也可引起CK19發(fā)生類似的調控機制，這還需開展體內外試驗研究進一步證實。