韓超逸，湯德元，曾智勇，黃 濤，王 彬，郭倩妤，廖少山，張 森，楊志剛，晏仁潭

(貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

日本乙型腦炎(Japanese encephalitis，JE)簡稱乙腦，是由日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一種人畜共患的蚊媒傳染病。JEV為黃病毒科，黃病毒屬，單股正鏈RNA病毒。JEV可感染人、馬、豬、水禽等多種動物，其中豬是其擴大宿主，人為其終末宿主[1]。JEV感染人可引起病毒性腦炎，死亡率達25%～30%，50%的存活者會留下永久性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后遺癥，如認知障礙、行為紊亂、失憶[2]。JEV感染豬可引起懷孕母豬流產(chǎn)，產(chǎn)木乃伊及死胎，公豬發(fā)生睪丸炎精液品質(zhì)下降，對豬業(yè)養(yǎng)殖造成巨大經(jīng)濟損失[3]。目前，JE并無特效治療藥物，控制JEV最有效的手段是接種疫苗。

1 JEV致病機制

JEV感染宿主后，可在淋巴結(jié)和外周組織中擴增造成一定的損傷[4-5]，并且JEV可損傷DCs功能，從而抑制CD4+T和CD8+T細胞發(fā)生免疫應(yīng)答，促進JEV在體內(nèi)擴散[6]，JEV在體內(nèi)擴散后可通過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，感染神經(jīng)元細胞，被感染的神經(jīng)元細胞釋放促炎因子和趨化因子，這些促炎因子和趨化因子可活化小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生更多的炎癥因子，并且JEV也可直接感染小膠質(zhì)細胞促進炎癥因子的釋放[7]，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中炎癥因子和趨化因子的增加，可募集外周免疫細胞進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，再次分泌大量細胞因子和趨化因子，如此循環(huán)反復(fù)導(dǎo)致了中樞神經(jīng)系統(tǒng)中“炎癥風暴”的發(fā)生，這也是導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的主要原因[8]。

2 JEV進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)途徑

血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)是由腦微血管內(nèi)皮細胞、周細胞、星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元細胞構(gòu)成的一道位于外周循環(huán)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間的屏障[9]。BBB是一種選擇透過性屏障，其既可以阻擋病原體和有害物質(zhì)，又嚴格控制著血液和腦內(nèi)的物質(zhì)交換，保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)不受侵害，維持腦內(nèi)微環(huán)境平衡[10]。

病原體進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)有4種途徑：跨神經(jīng)途徑，一些皰疹病毒可通過鼻腔感染嗅神經(jīng)元，病毒粒子進入嗅球之后感染膠質(zhì)細胞可引發(fā)病毒性腦炎[11]；跨細胞途徑，肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)可通過血管內(nèi)皮細胞間隙進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，整個過程并不破壞BBB[12]；細胞旁路途徑，西尼羅病毒(WNV)可感染血管內(nèi)皮細胞破壞BBB，進入腦內(nèi)引起腦部病毒性炎癥[13]；特洛伊木馬途徑，人免疫缺陷病毒(HIV)可感染T細胞，當攜帶HIV的T細胞通過BBB時可將HIV帶入大腦[14]。

崔寧一[15]通過足墊注射使小鼠感染JEV，7 d后分離小鼠的腦、嗅球和脊髓檢測JEV含量，發(fā)現(xiàn)在小鼠腦中檢測到JEV，但脊髓和嗅球均未檢測到JEV，表明在小鼠模型中JEV并未通過跨神經(jīng)途徑進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，JEV可感染CD3+T細胞、CD19+B細胞和Ly6c+單核細胞，分離感染JEV小鼠的脾臟細胞與內(nèi)皮細胞互作，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞上黏附了大量單核細胞，原因是JEV感染上調(diào)了單核細胞LFA-1、VLA-4黏附分子，以及內(nèi)皮細胞上相應(yīng)配體ICAM-1、VCAM-1的表達，增強了內(nèi)皮細胞與單核細胞的黏附作用。JEV對單核細胞及內(nèi)皮細胞黏附因子及配體的上調(diào)，增強了單核細胞與內(nèi)皮細胞的黏附作用，為JEV以特洛伊木馬途徑通過BBB進入大腦提供了理論支持。

3 JEV感染引起B(yǎng)BB受損

在腦部受到重創(chuàng)或病原體侵入時，BBB完整性和功能會遭到破壞，除此之外花生四烯酸、組胺等化學(xué)物質(zhì)也可破壞BBB。BBB受損會導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)失去保護，引起多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，在阿茲海默癥、中風、帕金森等多種疾病中都發(fā)現(xiàn)BBB完整性被破壞。緊密連接是BBB細胞之間的一種連接方式，對于維持BBB完整性有重要意義。緊密連接蛋白包括：咬合蛋白(occludin)、閉合蛋白(claudins)、連接黏附分子(junction adhesion molecules,JAMs)，閉合小環(huán)蛋白(zona occludin,ZO)可以將咬合蛋白和閉合蛋白連接在內(nèi)皮細胞骨架上[16]。當緊密連接蛋白occludin、claudin-5、ZO-1表達量及分布發(fā)生變化時，就意味著BBB的通透性和功能發(fā)生了變化[17]。

LI等[18]發(fā)現(xiàn)JEV進入大腦發(fā)生在BBB通透性增加之前，在JEV感染的小鼠大腦中，occludin、claudin-5、ZO-1表達量下降79.63%，56.65%和65.35%，表明JEV感染小鼠增加了BBB通透性。但使用JEV直接感染內(nèi)皮細胞發(fā)現(xiàn)occludin、ZO-1表達并無變化，而使用感染JEV小鼠的腦提取物處理內(nèi)皮細胞，發(fā)現(xiàn)2種蛋白表達顯著降低，表明JEV并非增加BBB通透性的直接原因，而是JEV感染所產(chǎn)生的炎性因子通過破壞BBB緊密連接，增加了BBB通透性。進一步研究發(fā)現(xiàn)，JEV感染注射抗IFN-γ抗體的小鼠與JEV感染小鼠相比，BBB受損程度減輕，表明抑制IFN-γ在JEV感染過程中對BBB有保護作用，IFN-γ可能是治療乙腦的潛在靶點。

婁文娟[19]發(fā)現(xiàn)JEV P3株可活化內(nèi)皮細胞，降低內(nèi)皮細胞的早期和晚期凋亡，上調(diào)黏附分子配體ICAM-1的表達。為探究JEV-P3株活化內(nèi)皮細胞是否破壞其細胞屏障功能，使用ECIS檢測JEV P3株感染內(nèi)皮細胞后，內(nèi)皮細胞的細胞電阻值及Rb值是否發(fā)生變化，發(fā)現(xiàn)JEV P3株感染內(nèi)皮細胞后，電阻值及Rb值并未發(fā)生變化，證明JEV P3株感染內(nèi)皮細胞并未破壞細胞屏障功能以及細胞間連接，而使用發(fā)病小鼠腦上清處理內(nèi)皮細胞，其電阻值及Rb值顯著下降，證明小鼠腦上清中含有的炎癥因子破壞了內(nèi)皮細胞的屏障功能和細胞間連接。內(nèi)皮細胞活化可黏附免疫細胞，使用ECIS檢測與JEV P3株處理脾臟細胞互作的內(nèi)皮細胞電阻值及Rb值，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞黏附免疫細胞并不改變內(nèi)皮細胞的屏障功能和細胞間連接，該研究證明JEV P3株可活化內(nèi)皮細胞但其并不影響其屏障功能及細胞間連接，進一步探究了JEV的致病機制。

WANG等[20]研究發(fā)現(xiàn)JEV感染小鼠過程中趨化因子IP-10一直維持高表達，是JEV感染中變化最早最顯著的趨化因子。中和IP-10可緩解JEV感染小鼠引起的BBB緊密蛋白變化，對BBB產(chǎn)生保護作用。但使用IP-10直接作用于內(nèi)皮細胞并不會破壞其完整性，表明趨化因子IP-10不能直接破壞BBB，進一步研究發(fā)現(xiàn)IP-10與其受體CXCR3結(jié)合后，可激活星形膠狀細胞MAPK信號通路，磷酸化的c-Jun N-末端激酶(JNK)可誘導(dǎo)下游早期轉(zhuǎn)錄因子c-Jun磷酸化，上調(diào)TNF-α的表達。TNF-α可下調(diào)occludin、claudin-5和ZO-1 3種蛋白的表達，并引起ZO-1向胞質(zhì)轉(zhuǎn)位，破壞BBB的完整性。該研究闡明了在JEV感染過程中高表達的趨化因子IP-10誘導(dǎo)下游TNF-α產(chǎn)生破壞BBB的機制，揭示了JEV感染引起B(yǎng)BB受損的新途徑。

4 JEV感染引起細胞凋亡

細胞凋亡是細胞在遇到外界刺激后為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)而發(fā)生的一種由基因控制的程序性死亡[21]。細胞凋亡途徑包括：死亡受體介導(dǎo)凋亡、細胞線粒體介導(dǎo)凋亡以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡。很多病毒感染細胞都可以引起細胞凋亡，如與JEV同屬黃病毒科的2型登革熱病毒(DENV2)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)均可誘導(dǎo)細胞凋亡[22-23]。對于宿主細胞而言凋亡可以限制病毒在體內(nèi)的擴散，對于病毒而言凋亡的發(fā)生有利于病毒的釋放，而凋亡的抑制可增加病毒在細胞內(nèi)的感染時間，利用宿主細胞產(chǎn)生更多的病毒粒子[24]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核生物中重要的細胞器，具有蛋白加工、維持鈣離子平衡、脂類代謝的功能[25]。當內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化或病原體感染時會引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可觸發(fā)由跨膜蛋白激酶1(IRE1)、活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)、雙鏈RNA活化蛋白激酶樣ER激酶(PERK)共同調(diào)控的非蛋白折疊反應(yīng)[26]。非蛋白折疊反應(yīng)可緩解一定程度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常功能，但持續(xù)性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，IRE1、ATF6、PERK會激活下游的C/EBP同源蛋白(CHOP)、JNK、Caspase-12觸發(fā)細胞凋亡[27]。

HUANG等[28]發(fā)現(xiàn)JEV感染BHK-21細胞可上調(diào)GRP48、ATF6、ATF4的轉(zhuǎn)錄水平，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可激活I(lǐng)RE1切割XBP1 mRNA，產(chǎn)生XBP1-s mRNA編碼具有轉(zhuǎn)錄活性的XBP1-s蛋白。XBP1和ATF6可促進下游CHOP蛋白表達引起細胞凋亡，使用Western blot檢測JEV感染BHK-21細胞GRP78、CHOP、ATF6蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)JEV感染可上調(diào)3種蛋白表達。使用IRE1抑制劑和JNK抑制劑處理細胞后能顯著的減少CHOP、Caspase-3、IRE1蛋白表達，抑制JEV引起的細胞凋亡，并且2種抑制劑不影響JEV復(fù)制，證實JEV可通過IRE1/JNK信號通路誘導(dǎo)BHK-21細胞凋亡；表明JEV引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是JEV致病過程中引起神經(jīng)元死亡的重要原因，為乙腦的治療和藥物的研發(fā)提供了新的思路和靶點。WANG等[29]發(fā)現(xiàn)JEV感染Neuro-2a細胞和小鼠后，體內(nèi)外磷酸化PERK和eIF2α的表達均升高及ATF4、CHOP蛋白上調(diào)，引起細胞凋亡。使用PERK抑制劑處理細胞，可抑制PERK和eIF2α的磷酸化及ATF4、CHOP蛋白表達，顯著減少JEV引起的細胞病變和凋亡，表明JEV可通過激活PERK-ATF4-CHOP途徑引起細胞凋亡。并且JEV非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B 可通過其LIG-FHA和LIG-WD40域與PERK相互作用，可促進PERK發(fā)生二聚化激活PERK，向小鼠顱內(nèi)注射表達NS4B的質(zhì)粒，可激活PERK促進腦細胞凋亡及誘發(fā)腦炎。WANG等[29]揭示了JEV非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B與宿主細胞互作誘導(dǎo)細胞凋亡的機制，為JEV的治療提供了新的方向和理論支持。

p53是一種轉(zhuǎn)錄因子，磷酸化的p53進入細胞核可啟動與細胞生長和凋亡有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。p53可通過死亡受體途徑、線粒體途徑，誘導(dǎo)細胞凋亡。鄧緒芳[30]研究發(fā)現(xiàn)，p53可抑制JEV復(fù)制，JEV感染細胞可引起p53轉(zhuǎn)錄水平下降，降低細胞內(nèi)p53蛋白水平。JEV感染轉(zhuǎn)染p53 siRNA的細胞，細胞凋亡率相對于轉(zhuǎn)染NC siRNA組要高出3.4%，表明JEV引起的細胞凋亡不依賴p53。進一步研究發(fā)現(xiàn)細胞缺失p53可上調(diào)Xaf1表達，p53基因敲除小鼠腦組織Xaf1表達水平是野生型小鼠的89倍，Xaf1可通過抑制Xiap增加Caspases的活性促進細胞凋亡。以上結(jié)果表明，JEV感染p53基因缺失細胞增加細胞凋亡比例，其原因可能為p53基因缺失，可促進JEV復(fù)制感染更多的細胞，增加細胞凋亡；p53基因缺失可上調(diào)Xaf1表達促進細胞凋亡。鄧緒芳[30]發(fā)現(xiàn)了p53在JEV感染過程中的生物學(xué)功能，JEV通過抑制p53增加病毒增殖，促進細胞凋亡增強其致病力。

叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族O亞族(FOXO)是一類在生物活性中具有重要功能的轉(zhuǎn)錄因子，參與細胞生長代謝、分化、氧化應(yīng)激、DNA損傷修復(fù)、腫瘤發(fā)生、細胞凋亡等。GUO等[31]發(fā)現(xiàn)沉默F(xiàn)OXO可促進JEV引起的細胞凋亡，而過表達FOXO可抑制JEV引起的細胞凋亡，但FOXO含量變化對JEV復(fù)制并無影響。JEV感染Neuro-2a細胞可下調(diào)細胞內(nèi)FOXO以及FOXO信號通路下游的抗凋亡蛋白Bcl-6、p21的mRNA含量，細胞過表達FOXO后，Bcl-6、p21表達升高，JEV感染過表達FOXO的細胞，細胞凋亡比率降低。以上結(jié)果表明，JEV感染Neuro-2a細胞后，可通過下調(diào)FOXO信號通路中的Bcl-6和p21的表達，誘導(dǎo)細胞凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO啟動子區(qū)域可與STAT3結(jié)合，JEV感染細胞可降低STAT3蛋白表達，抑制STAT3與FOXO啟動子結(jié)合，降低FOXO表達。表明JEV感染Neuro-2a細胞可通過抑制STAT3蛋白表達降低STAT3與FOXO啟動子結(jié)合，下調(diào)FOXO表達導(dǎo)致FOXO信號通路下游抗凋亡蛋白p21和Bcl-6表達減少，誘導(dǎo)Neuro-2a細胞凋亡。該研究發(fā)現(xiàn)JEV可通過抑制STAT3-FOXO-Bcl-6/p21信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡，不僅揭示了新的JEV致病分子機制，也為JE藥物的研發(fā)提供了新的思路和靶點。

5 小結(jié)

JEV是一類危害人類健康和豬業(yè)養(yǎng)殖業(yè)的重要病原體，可通過蚊蟲為媒介傳播。JEV感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起病毒性腦炎以及神經(jīng)細胞的大量死亡，是JEV最重要的致病機制。感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)第一步就是要跨過BBB，以目前的研究結(jié)果來看在小鼠模型中跨神經(jīng)途徑并不是JEV進入中樞系統(tǒng)的途徑，而JEV可感染免疫細胞以及上調(diào)免疫細胞黏附分子，內(nèi)皮細胞相應(yīng)配體的表達，為以特洛伊木馬途徑進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)提供了依據(jù)。JEV感染可引起B(yǎng)BB受損，但很多研究表明[18-20]JEV并不是破壞BBB的直接原因，JEV感染內(nèi)皮細胞并未破壞細胞屏障功能以及細胞間連接，而JEV感染所產(chǎn)生炎性因子和趨化因子如：IFN-γ、TNF-α，可破壞BBB的完整性和功能。對于JEV感染引起的細胞凋亡，一些研究表明[28-29]JEV感染可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活I(lǐng)ER1/JNK、PERK-ATF4-CHOP信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡。除此之外，F(xiàn)OXO、p53轉(zhuǎn)錄因子在JEV誘導(dǎo)細胞凋亡中有著重要作用，2種轉(zhuǎn)錄因子的沉默均可增加JEV引起的細胞凋亡，而JEV感染可引起2種轉(zhuǎn)錄因子的下調(diào)誘導(dǎo)細胞凋亡[30-31]。對JEV感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)過程中，跨越BBB的途徑，引起B(yǎng)BB損傷，誘導(dǎo)細胞凋亡的研究進行總結(jié)論述，為JEV的致病機制研究提供參考，以及為JEV藥物的研發(fā)提供新的思路。