馬靜文，王琳琳，張燕，武婭婭，陳聰，吳娟花，連若純，楊菁*，李龍飛*

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，湖北省輔助生殖與胚胎發(fā)育醫(yī)學(xué)臨床研究中心，武漢 430060；2. 深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳 518045；3.深圳中山泌尿外科醫(yī)院婦產(chǎn)科，深圳 518045)

受精卵著床后，子宮內(nèi)膜間質(zhì)增殖再分化形成蛻膜組織，其結(jié)構(gòu)與功能的正常對妊娠的建立和維持具有重要的意義[1]。胚胎攜帶有一半母方一半父方的基因，對于母體來說是一種獨(dú)特的同種異型移植物。在正常妊娠過程中，胚胎得以在母體子宮中存活發(fā)育而不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)有賴于母胎界面特殊的免疫耐受機(jī)制[2]。位于母胎界面的蛻膜組織內(nèi)的免疫細(xì)胞在維持母體對胎兒的免疫耐受中起著重要的作用，妊娠前后免疫細(xì)胞譜的變化使得各類免疫細(xì)胞共同參與了妊娠的維持，而免疫微環(huán)境的失調(diào)則會(huì)導(dǎo)致妊娠失敗甚至發(fā)生流產(chǎn)。

本研究通過免疫組織化學(xué)法對正常黃體中期內(nèi)膜、人工流產(chǎn)患者蛻膜及稽留流產(chǎn)患者蛻膜中各類免疫細(xì)胞標(biāo)志物進(jìn)行檢測，初步觀察各類免疫細(xì)胞標(biāo)志物于妊娠前后的變化及與妊娠結(jié)局的關(guān)系，以期描繪出妊娠早期免疫細(xì)胞譜及免疫微環(huán)境改變對妊娠結(jié)局的影響，為臨床妊娠免疫失衡的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、研究對象

選取2017年9月至2018年9月在深圳中山泌尿外科醫(yī)院婦科收治的17例稽留流產(chǎn)患者(稽留流產(chǎn)組)、34例行人工流產(chǎn)的正常早孕患者(人工流產(chǎn)組)及同期于本院生殖醫(yī)學(xué)中心治療且首個(gè)IVF周期試孕成功的27例女性(正常內(nèi)膜組)為研究對象。

診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)稽留流產(chǎn)(超聲診斷標(biāo)準(zhǔn))：頭臀比≥7 mm，未見胎心搏動(dòng)；宮內(nèi)妊娠囊平均直徑≥25 mm，未見胚胎；宮內(nèi)妊娠未見卵黃囊，2周后仍未見胚胎及胎心搏動(dòng)；宮內(nèi)妊娠可見卵黃囊，11 d后仍無胎心搏動(dòng)。(2)人工流產(chǎn)：符合早孕診斷標(biāo)準(zhǔn)并自愿終止妊娠；符合人工流產(chǎn)術(shù)手術(shù)指征。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者年齡20～40歲，流產(chǎn)組(人工流產(chǎn)組和稽留流產(chǎn)組)妊娠時(shí)間5～12周；(2)各組宮腔形態(tài)正常，無子宮畸形、粘連等器質(zhì)性疾病；(3)無全身感染性疾病，取樣前3個(gè)月無任何用藥史，流產(chǎn)組均無自然流產(chǎn)及死胎史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病史；(2)有家族遺傳及系統(tǒng)性疾病等；(3)流產(chǎn)胚胎檢測有染色體異常。

二、研究方法

1.子宮內(nèi)膜及蛻膜的收集：(1)子宮內(nèi)膜：月經(jīng)周期第10天起，尿LH及B超結(jié)合監(jiān)測排卵情況，排卵后第7～8天利用子宮內(nèi)膜取樣器(Gynetics，Belgium，比利時(shí))刮取少量子宮內(nèi)膜組織，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗去除組織表面血污。(2)蛻膜：患者行常規(guī)消毒、麻醉后取膀胱截石位，多普勒彩色超聲確認(rèn)孕囊位置后行擴(kuò)宮處理，在腹部B超的引導(dǎo)下，負(fù)壓吸引妊娠囊行刮宮術(shù)。將所得胚胎組織投入95%酒精中固定待病檢，分離蛻膜組織后待固定。

2.固定及包埋：將處理好的內(nèi)膜/蛻膜組織于10%中性福爾馬林固定液固定4～6 h，將固定好的組織置于組織盒中放入全自動(dòng)組織脫水機(jī)行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟及包埋待測。

3.免疫組化檢測：石蠟包埋的子宮內(nèi)膜及蛻膜組織做4 μm厚度的切片，按照顯色試劑盒(Leica，美國)操作說明，運(yùn)用自動(dòng)免疫組織化學(xué)儀(Leica，Bond ΙΙΙ，美國)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：常規(guī)梯度脫蠟后，采用3%的過氧化氫試劑封閉內(nèi)源性過氧化物酶15 min，10%的胎牛血清封閉20 min以阻斷非特異性染色；EDTA或檸檬酸抗原修復(fù)液進(jìn)行微波加熱處理，采用如下一抗(表1)：CD56、CD68、CD83、CD8、Foxp3、CD1a 37℃孵育1 h后，加鼠、兔通用二抗37℃孵育30 min；再滴加DAB工作液顯色，至棕黃色時(shí)停止染色，蘇木素復(fù)染后氨水返藍(lán)，進(jìn)行梯度酒精脫水，樹膠封片。

表1 抗體情況

4.免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定：本研究采用Vectra自動(dòng)病理成像定量分析系統(tǒng)(Perkin Elmer，美國)定量分析子宮內(nèi)膜及蛻膜組織中各免疫細(xì)胞數(shù)量。首先低倍鏡掃描完整的切片，然后在高倍視野下(放大倍數(shù)×200)隨機(jī)采集30張圖像。使用InForm多光譜圖像分析軟件進(jìn)行圖譜的光譜分析，準(zhǔn)確測定各類不同的信號。根據(jù)每個(gè)免疫靶標(biāo)的著色不同，對不同玻片的染色進(jìn)行不同的光譜拆分，訓(xùn)練軟件自動(dòng)識別每個(gè)視野中的組織區(qū)域、空白區(qū)域，并計(jì)數(shù)組織區(qū)域內(nèi)的所有的子宮內(nèi)膜或蛻膜細(xì)胞及陽性細(xì)胞。最后，選取組織區(qū)域所占面積超過80%全視野的20張圖像納入統(tǒng)計(jì)分析。將陽性細(xì)胞率定義為陽性免疫細(xì)胞數(shù)/子宮內(nèi)膜或蛻膜細(xì)胞總數(shù)×100%，最終計(jì)算這20張圖像的陽性免疫細(xì)胞率的平均值作為該免疫細(xì)胞的陽性率。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者一般資料比較

本研究共納入78例患者，其中正常內(nèi)膜組27例，人工流產(chǎn)組34例，稽留流產(chǎn)組17例。正常內(nèi)膜組：平均年齡(31.6±4.2)歲；自然黃體中期。人工流產(chǎn)組：平均年齡(32.2±6.5)歲；孕周5～9周，平均孕周(6.3±1.0)周。稽留流產(chǎn)組：平均年齡(33.8±4.6)歲；孕周6～9周，平均孕周(6.8±0.7)周。各組患者間一般資料均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

二、子宮內(nèi)膜及蛻膜組織中免疫細(xì)胞的數(shù)量變化

1.妊娠前后免疫細(xì)胞譜的變化：在人工流產(chǎn)組中，CD56+細(xì)胞、CD68+細(xì)胞及CD83+細(xì)胞這3類免疫細(xì)胞數(shù)均高于正常內(nèi)膜組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；而CD8+細(xì)胞、Foxp3+細(xì)胞和CD1a+細(xì)胞這3類免疫細(xì)胞數(shù)與正常內(nèi)膜組相比均無顯著變化(P>0.05)(圖1、表2)。

正常內(nèi)膜組為黃體中期內(nèi)膜組織，人流/稽留組均為孕7周蛻膜組織。A：CD56+陽性細(xì)胞率；B：CD68+陽性細(xì)胞率；C：CD83+陽性細(xì)胞率；D：CD8+陽性細(xì)胞率；E：Foxp3+陽性細(xì)胞率；F：CD1a+陽性細(xì)胞率。紅色箭頭所示為陽性細(xì)胞。組間比較，*P<0.05，#P<0.01，?P<0.001圖1 不同組間子宮內(nèi)膜及蛻膜各類免疫細(xì)胞陽性率比較

表2 正常內(nèi)膜組與人工流產(chǎn)組間子宮內(nèi)膜/蛻膜組織各免疫細(xì)胞陽性細(xì)胞率比較(%)

2.稽留流產(chǎn)對妊娠免疫細(xì)胞譜的影響：稽留流產(chǎn)組蛻膜組織中CD68+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞和Foxp3+細(xì)胞數(shù)均高于人工流產(chǎn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而CD56+細(xì)胞、CD83+細(xì)胞和CD1a+細(xì)胞數(shù)均無顯著性變化(P>0.05)(圖1、表3)。

表3 人工流產(chǎn)組與稽留流產(chǎn)組組間蛻膜組織各免疫細(xì)胞陽性細(xì)胞率比較(%)

三、蛻膜免疫細(xì)胞數(shù)量隨孕周的變化

以人工流產(chǎn)組蛻膜免疫細(xì)胞數(shù)為基準(zhǔn)觀察蛻膜免疫細(xì)胞隨孕周的變化情況，其中孕5周檢測4例、孕6周20例、孕7周5例、孕8周3例、孕9周2例。對于CD56+細(xì)胞、CD68+細(xì)胞和CD83+細(xì)胞，孕5周開始顯著上升(P<0.05)后在5～9周未有明顯數(shù)量變化，其中CD83+細(xì)胞在孕9周又有明顯上升；對于CD8+細(xì)胞，孕8周開始顯著上升(P<0.05)后保持恒定數(shù)量；對于Foxp3+細(xì)胞，早孕期蛻膜中數(shù)量無顯著變化(P>0.05)；對于CD1a+細(xì)胞，早孕期蛻膜中數(shù)量在孕9周顯著下降(P<0.05)(圖2)。

不同孕周與黃體中期比較，*P<0.05，#P<0.01，?P<0.001圖2 早孕期蛻膜各類免疫細(xì)胞變化趨勢

討 論

妊娠早期的蛻膜化子宮內(nèi)膜構(gòu)成了母胎界面的重要成分，在維持妊娠的過程中，母胎界面大量的免疫細(xì)胞參與了母體免疫耐受的調(diào)節(jié)作用，使得胚胎在植入過程以及后續(xù)的妊娠過程中不被母體所排斥[3]。妊娠期母體子宮內(nèi)膜的免疫細(xì)胞數(shù)量和功能會(huì)發(fā)生很大的變化，具體表現(xiàn)為免疫排斥的減弱和保護(hù)反應(yīng)的增強(qiáng)，使母體與胎兒之間處于一種免疫平衡的狀態(tài)，有助于更好的維持妊娠[4]。而這種免疫平衡的狀態(tài)一旦被打破則會(huì)產(chǎn)生不良的妊娠結(jié)局。

CD56是一種神經(jīng)細(xì)胞粘連因子，主要表達(dá)在所有的NK細(xì)胞、少部分的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞及一部分神經(jīng)組織中[5]。它是NK細(xì)胞重要的表面標(biāo)志物。在本研究中，在妊娠早期，NK細(xì)胞在母胎界面大量聚集，成為最主要的免疫細(xì)胞，在胚胎植入這一關(guān)鍵時(shí)期大量出現(xiàn)的NK細(xì)胞究竟扮演著什么樣的角色呢？蛻膜NK細(xì)胞是以分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)為主的NK3細(xì)胞[6]。TGF-β能夠誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜發(fā)生蛻膜樣變化，使滋養(yǎng)層向無侵蝕性的合體滋養(yǎng)層細(xì)胞分化；蛻膜NK細(xì)胞還能產(chǎn)生金屬蛋白酶抑制劑和纖溶酶原啟動(dòng)抑制因子，借此調(diào)節(jié)金屬蛋白酶和纖溶酶的活性，抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的過度侵蝕；除此之外，蛻膜NK細(xì)胞還能分泌IFN-γ，在蛻膜化過程中發(fā)揮著對血管分化與生長的調(diào)控作用。這些機(jī)制使得胎兒組織能夠不被母體所排斥，維持了母體對半同種異體胎兒的耐受性[7]。妊娠早期增多的NK細(xì)胞在維持母胎免疫耐受中發(fā)揮著重要的作用。

巨噬細(xì)胞是母胎免疫耐受的核心細(xì)胞之一，它可通過識別耐受胚胎抗原從而直接影響妊娠結(jié)局，CD68是巨噬細(xì)胞表面重要的標(biāo)志分子[8]。本研究中，蛻膜巨噬細(xì)胞成為第二大主要聚集的蛻膜免疫細(xì)胞。蛻膜巨噬細(xì)胞是子宮中重要的抗原提呈細(xì)胞，主要分布在子宮螺旋動(dòng)脈外膜和血管壁中，有研究證實(shí)，在子宮螺旋動(dòng)脈重塑的過程中，巨噬細(xì)胞先于初期滋養(yǎng)層細(xì)胞聚集于子宮螺旋動(dòng)脈周圍[9]。在重塑過程中，蛻膜巨噬細(xì)胞能夠及時(shí)吞噬清除發(fā)生凋亡的血管平滑肌細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞碎片，防止炎性物質(zhì)釋放到周圍組織引起炎性反應(yīng)影響胚胎的發(fā)育。除了重要的吞噬作用來保護(hù)子宮組織環(huán)境，蛻膜巨噬細(xì)胞還能夠分泌多種細(xì)胞因子，包括與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)的細(xì)胞因子：IL-1、IL-10和TNF-α，與血管生長相關(guān)的細(xì)胞因子：血管生成素、各類基質(zhì)金屬蛋白酶，這些細(xì)胞因子在免疫應(yīng)答、代謝與修復(fù)、血管生成等方面發(fā)揮著重要的作用[10]。雖然大量增多的巨噬細(xì)胞在維持母胎免疫耐受發(fā)揮重要作用，但我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，稽留流產(chǎn)組患者蛻膜巨噬細(xì)胞數(shù)量相較于人工流產(chǎn)患者組有明顯的上升，與Svensson-Arvelund等[11]的研究中流產(chǎn)患者中巨噬細(xì)胞增多并活化導(dǎo)致流產(chǎn)的結(jié)果相一致。這些結(jié)果表明，妊娠早期母體巨噬細(xì)胞在子宮局部過多的激活和浸潤可能是導(dǎo)致自然流產(chǎn)和子癇前期等病理性妊娠的重要原因，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

除了上述兩種重要的免疫細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞在妊娠維持中也起著重要的作用，不僅能介導(dǎo)母體對外來抗原產(chǎn)生防御性免疫應(yīng)答，更能介導(dǎo)蛻膜對胚胎的免疫耐受。在本研究中，將CD83作為成熟樹突狀細(xì)胞的標(biāo)志物，CD1a作為未成熟樹突狀細(xì)胞的標(biāo)志物來檢測兩類樹突狀細(xì)胞的表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)，成熟的樹突狀細(xì)胞在早孕期顯著增加，而未成熟樹突狀細(xì)胞無顯著變化。有研究顯示蛻膜樹突狀細(xì)胞與子宮蛻膜血管生成有關(guān)[12]。Blois等[13]的研究顯示，接種樹突狀細(xì)胞能夠減少妊娠小鼠的自然流產(chǎn)發(fā)生率，但其確切的調(diào)節(jié)機(jī)制有待深入研究。而在小鼠的圍植入期去除樹突狀細(xì)胞時(shí)，子宮部分蛻膜出現(xiàn)分化缺陷，植入過程受損，植入位點(diǎn)的血管減少，基質(zhì)細(xì)胞增生缺陷，胎盤發(fā)育受損及妊娠失敗[13]。所以在妊娠時(shí)母胎界面大量出現(xiàn)的成熟蛻膜樹突狀細(xì)胞可能在胚胎植入及妊娠維持中發(fā)揮著重要的作用。

除了上述免疫細(xì)胞外，蛻膜中還有一定量的T細(xì)胞發(fā)揮著重要的作用。在妊娠早期，一方面CD8+T細(xì)胞表現(xiàn)為暫時(shí)性細(xì)胞毒性功能障礙，有益于免疫耐受的維持[14]；另一方面，在滋養(yǎng)層細(xì)胞的刺激下，蛻膜CD8+T細(xì)胞高表達(dá)Tim-3、CTLA-4或PD-1，使其具有高增殖性，從而分泌大量的IL-4和IL-10等細(xì)胞因子，對母胎耐受維持具有積極的作用[15]。在Lachapelle等[16]的研究中，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)人群患者蛻膜中CD8+T細(xì)胞數(shù)量明顯減少，這進(jìn)一步證明CD8+T細(xì)胞對于妊娠維持具有重要作用。然而在本研究中，稽留流產(chǎn)患者組中CD8+T細(xì)胞數(shù)量卻顯著上升，這與Galgani等[17]在正常人群和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者對照研究中的結(jié)果一致，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者蛻膜中CD8+T細(xì)胞數(shù)量顯著增加。表明過多的CD8+T細(xì)胞可能也會(huì)帶來不良妊娠結(jié)局。不同的檢測人群、樣本量的大小及實(shí)驗(yàn)環(huán)境等差異可能會(huì)造成以上相悖的結(jié)論，蛻膜CD8+T細(xì)胞對于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及稽留流產(chǎn)患者的影響還需要更深入的研究。

除了CD8+T細(xì)胞在稽留流產(chǎn)患者組中顯著上升，以Foxp3+為表面標(biāo)記的Treg細(xì)胞的數(shù)量也顯著增加。Treg是一類調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[18]，于妊娠早期迅速升高，能夠釋放TGF-β、IL-10等細(xì)胞因子來抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡，誘導(dǎo)子宮螺旋動(dòng)脈重塑及胎盤的發(fā)育，在母胎免疫耐受及早期妊娠維持中發(fā)揮著重要作用[19-21]。早在2004年，Sasaki等[22]的研究就初次報(bào)道了Treg細(xì)胞與自然流產(chǎn)的關(guān)系，他們發(fā)現(xiàn)自然流產(chǎn)患者外周血和蛻膜中的Treg細(xì)胞數(shù)顯著低于人工流產(chǎn)患者組，并提出流產(chǎn)的發(fā)生可能與Treg細(xì)胞數(shù)量增加不足有關(guān)；近年來的研究也顯示，不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者蛻膜的Treg細(xì)胞數(shù)顯著低于正常女性組[23]。然而本研究得出了相反的結(jié)論，稽留流產(chǎn)組相較于人工流產(chǎn)組患者蛻膜Treg細(xì)胞數(shù)顯著上升。另外，Treg細(xì)胞可能與來源于同一細(xì)胞系的Th17細(xì)胞協(xié)同參與妊娠的維持。研究發(fā)現(xiàn)，Th17/Treg細(xì)胞的平衡在其中發(fā)揮著重要的作用[24]。Th17/Treg細(xì)胞失衡將誘導(dǎo)其他免疫細(xì)胞分泌IL-22、γ-干擾素及TNF-α等免疫殺傷因子，影響正常的胎盤細(xì)胞的分化生長，最終使滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)育異常，母體對胚胎產(chǎn)生排斥作用，導(dǎo)致流產(chǎn)[25]。本研究中僅研究了Treg細(xì)胞數(shù)量在稽留流產(chǎn)組中的變化，不能全面反映Th17/Treg細(xì)胞平衡狀態(tài)的變化，有待進(jìn)一步對Th17細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物進(jìn)行測定，探究Th17/Treg細(xì)胞平衡與流產(chǎn)的關(guān)系。

綜上所述，妊娠早期，子宮蛻膜中大量增加的NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及成熟樹突狀細(xì)胞均在母胎免疫耐受及妊娠的維持中發(fā)揮著重要的作用。了解早孕期子宮蛻膜免疫細(xì)胞譜能夠更好地理解生殖免疫在妊娠的建立和維持中發(fā)揮的作用。其中，稽留流產(chǎn)患者組中顯著增加的CD68+巨噬細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞可能與自發(fā)流產(chǎn)有關(guān)，這可能與免疫耐受機(jī)制被破壞有關(guān)，其具體機(jī)制還需要深入的研究。對于Treg細(xì)胞的分析，需要加入同一源系的Th17細(xì)胞來綜合探討Th17/Treg細(xì)胞之間的平衡對于自發(fā)流產(chǎn)的影響。本研究采用的全自動(dòng)免疫組織化學(xué)儀器及自動(dòng)病理成像定量分析系統(tǒng)已應(yīng)用于臨床免疫細(xì)胞分析，從標(biāo)本的收集制備蠟塊到實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析已形成系統(tǒng)化的平臺[26-27]，相較于流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)，除了可以進(jìn)行定量各免疫細(xì)胞，更方便定位這些免疫細(xì)胞表達(dá)位置是否存在差異。但由于本研究所選取的稽留流產(chǎn)組樣本并未在胎停的時(shí)刻進(jìn)行取樣，受到機(jī)體本身免疫防御的影響，可能會(huì)對免疫細(xì)胞的數(shù)量產(chǎn)生影響；除此之外本研究中樣本量較少，人工流產(chǎn)患者多在早孕期檢測出妊娠陽性時(shí)選擇進(jìn)行手術(shù)，對于孕周較大的樣本取樣困難，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來進(jìn)行大樣本的對照研究，描繪出更為全面、可信度更高的早孕期蛻膜免疫細(xì)胞譜。