李萍萍，初國(guó)銘，譚季春*

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，沈陽(yáng) 110022；2.遼寧省生殖障礙疾病與生育力重塑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110022；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院臨床遺傳科，沈陽(yáng) 110004)

隨著醫(yī)學(xué)研究和技術(shù)的不斷進(jìn)步，輔助生殖技術(shù)(ART)已成為治療不孕癥的主要方法[1]。2016年，我國(guó)實(shí)施的IVF周期超過(guò)90萬(wàn)個(gè)，分娩新生兒30萬(wàn)例[2]。越來(lái)越多的不孕癥患者期待通過(guò)ART治療獲得妊娠，然而仍有一部分患者的IVF周期結(jié)局并不理想。探索相關(guān)影響因素對(duì)于預(yù)測(cè)IVF治療結(jié)局或給予相應(yīng)的干預(yù)措施具有重要的指導(dǎo)意義。影響IVF周期生殖結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)因素是多方面的。英國(guó)國(guó)家健康護(hù)理優(yōu)化研究院(The National Institute for Health and Care Excellence，NICE)臨床指南推薦將女性年齡、既往ART治療次數(shù)、既往妊娠史、體重指數(shù)和生活方式因素用于預(yù)測(cè)IVF結(jié)局，還提出胚胎移植數(shù)量、卵巢儲(chǔ)備(抗苗勒管激素水平、竇卵泡數(shù)、FSH水平等)、不孕年限、不孕原因、獲卵數(shù)和可移植胚胎數(shù)對(duì)預(yù)測(cè)IVF結(jié)局也有重要的價(jià)值[3]。近年來(lái)，一些其它影響因素如空氣污染物[4]、炎癥因素[5-6]、生殖道菌群[7]等相繼被發(fā)現(xiàn)與IVF結(jié)局密切相關(guān)。

已有研究顯示，IVF周期妊娠組與未妊娠組胚胎培養(yǎng)基中的氨基酸水平存在顯著差異，胚胎培養(yǎng)第3天的培養(yǎng)基中丙氨酸水平與胚胎移植后妊娠結(jié)局負(fù)相關(guān)[8-9]；而妊娠并發(fā)癥(妊娠期糖尿病或妊娠期高血壓)女性血液氨基酸代謝水平也發(fā)生了顯著改變[10]，提示氨基酸代謝與妊娠相關(guān)的胚胎發(fā)育和母體健康息息相關(guān)。本研究擬通過(guò)對(duì)本中心不孕癥患者IVF-ET后驗(yàn)孕日的血液氨基酸代謝組學(xué)進(jìn)行分析，以明確影響IVF結(jié)局的氨基酸種類，為IVF的治療和結(jié)局預(yù)測(cè)提供參考。

資料和方法

一、研究對(duì)象

選擇2020年4月至2020年8月在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院生殖中心接受IVF-ET治療、并參與中國(guó)人群輔助生殖人口及子代隊(duì)列建立與應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目的100例患者作為研究對(duì)象。

納入標(biāo)準(zhǔn)：IVF-ET周期。排除標(biāo)準(zhǔn)：驗(yàn)孕日未在本中心留取外周血樣。本研究通過(guò)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(倫理批號(hào)2017PS269K)；所有患者均簽署知情同意書(shū)。

二、研究方法

1.分組：根據(jù)胚胎移植后約2周(驗(yàn)孕日，第11～15天)進(jìn)行血β-HCG測(cè)定的驗(yàn)孕結(jié)果和移植后28～35 d超聲驗(yàn)孕結(jié)果，將患者分為妊娠組(β-HCG≥2.90 U/L，且超聲顯示妊娠囊和妊娠囊內(nèi)見(jiàn)胎心、胎芽)和未妊娠組(β-HCG<2.90 U/L或超聲未見(jiàn)妊娠囊、胎心、胎芽)。

2.氨基酸代謝組學(xué)分析：通過(guò)液相色譜-串聯(lián)色譜技術(shù)(Liquid chromatography tandem chromatography，LC-MS/MS)檢測(cè)18種血液氨基酸的濃度，干血濾紙片經(jīng)含氨基酸內(nèi)標(biāo)的甲醇萃取，鹽酸正丁醇衍生后，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，質(zhì)控標(biāo)本采用美國(guó)疾控中心提供的標(biāo)準(zhǔn)濾紙片，利用已知內(nèi)標(biāo)的濃度計(jì)算出所測(cè)氨基酸濃度。進(jìn)一步將與妊娠結(jié)局相關(guān)的氨基酸按濃度高低進(jìn)行分組分析，同時(shí)分析妊娠組患者血β-HCG水平與氨基酸濃度的相關(guān)性。

3.促排卵及IVF-ET：所有患者的控制性促排卵方案及IVF-ET均按照本中心常規(guī)治療及操作規(guī)程進(jìn)行。

4.觀察指標(biāo)：收集所有患者的一般資料，包括年齡、體重指數(shù)(BMI)、不孕年限、基礎(chǔ)FSH水平、抗苗勒管激素(AMH)水平、周期數(shù)、HCG日/轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度、不孕病因、周期類型、促排卵方案、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案、移植的胚胎數(shù)量和胚胎質(zhì)量、血β-HCG水平等數(shù)據(jù)。卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎的定義為8～10細(xì)胞I級(jí)或II級(jí)的D3～D4胚胎，囊胚期優(yōu)質(zhì)胚胎定義為Gardner囊胚評(píng)分AA/AB/BA/BB的胚胎。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者一般資料

本研究共納入100例IVF-ET助孕治療的不孕癥患者，根據(jù)妊娠結(jié)局將患者分為妊娠組(63例)和未妊娠組(37例)。兩組患者間年齡、基礎(chǔ)FSH值、AMH水平、移植胚胎數(shù)和胚胎類型均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，妊娠組患者的年齡更小、基礎(chǔ)FSH水平更低、AMH水平更高、移植胚胎數(shù)更少、HCG日/轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度更厚、囊胚移植比例更高；兩組患者間BMI、不孕年限、促排卵方案、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案和移植胚胎質(zhì)量均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 患者一般資料比較[(-±s)，n(%)]

二、兩組患者血液氨基酸濃度比較

妊娠組患者血液中瓜氨酸的濃度顯著低于未妊娠組，而谷氨酰胺和絲氨酸的濃度顯著高于未妊娠組(P<0.05)，其它氨基酸濃度均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。由于妊娠組囊胚移植比例高，因此進(jìn)一步將所有患者分為卵裂期胚胎移植組和囊胚移植組，分析兩個(gè)亞組患者氨基酸水平的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)亞組患者間血液氨基酸濃度均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 患者血液氨基酸濃度(μmol/L)比較(M[P25，P75])

三、血液氨基酸濃度與妊娠結(jié)局之間的相關(guān)性

單因素Logistic回歸分析表明，血液瓜氨酸濃度越低、谷氨酰胺和絲氨酸濃度越高，妊娠的概率越高(P<0.05)。在校正了年齡、BMI、不孕年限、基礎(chǔ)FSH水平、AMH值、移植的胚胎數(shù)量、HCG日/轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度、不孕病因和移植胚胎類型等混雜因素后，多因素Logistic回歸分析表明，瓜氨酸濃度仍與妊娠呈負(fù)相關(guān)，而絲氨酸濃度與妊娠呈正相關(guān)(P<0.05)(表3)。

表3 血液氨基酸濃度與妊娠結(jié)局的Logistic回歸分析

進(jìn)一步根據(jù)血液瓜氨酸和絲氨酸濃度三分位分組后，分析氨基酸濃度與妊娠結(jié)局的相關(guān)性。結(jié)果表明：與低濃度組相比，瓜氨酸高濃度組獲得臨床妊娠的概率降低71.9%；而絲氨酸中等濃度組獲得臨床妊娠的概率是低濃度組的2.65倍，高濃度組獲得臨床妊娠的概率是低濃度組的2.415倍(表4)。

表4 血液瓜氨酸和絲氨酸濃度分組與妊娠結(jié)局的相關(guān)性分析

由于妊娠組與未妊娠組血液β-HCG水平具有顯著差異，我們初步分析了妊娠組患者血液β-HCG水平與不同氨基酸濃度的相關(guān)性。線性回歸分析表明，血液β-HCG水平與丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、鳥(niǎo)氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸濃度負(fù)相關(guān)，與精氨酸濃度正相關(guān)(P<0.05)；在校正了混雜因素后，多元回歸分析表明血液β-HCG水平與丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、鳥(niǎo)氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸濃度負(fù)相關(guān)，與精氨酸濃度正相關(guān)(P<0.05)(表5)。

表5 血液氨基酸濃度與臨床妊娠患者血β-HCG值相關(guān)性分析

進(jìn)一步將妊娠組患者根據(jù)血液β-HCG水平三分位分組，分成低[24.00～658.94 U/L)、中[658.95～1 918.67 U/L)、高[1 918.68～4 264.00 U/L)3個(gè)水平組，分析β-HCG水平與氨基酸濃度的相關(guān)性。結(jié)果表明：高水平β-HCG和低水平β-HCG患者血液丙氨酸、精氨酸、瓜氨酸和谷氨酸濃度均無(wú)顯著差異(P>0.05)；與β-HCG中水平組相比，β-HCG低水平組丙氨酸、谷氨酸濃度均顯著升高(P<0.05)(表6)。

表6 臨床妊娠患者血液β-HCG水平與氨基酸濃度的相關(guān)性分析

討 論

氨基酸對(duì)胎兒生長(zhǎng)非常重要，而母體血液氨基酸的濃度是影響胎兒氨基酸供應(yīng)的重要因素之一，當(dāng)胎兒氨基酸供應(yīng)中斷可能導(dǎo)致胎兒生長(zhǎng)受限或巨大兒。一項(xiàng)薈萃分析表明，補(bǔ)充精氨酸家族的氨基酸可改善合并妊娠疾病有妊娠并發(fā)癥孕婦的胎兒出生體重，降低高危人群分娩小于胎齡兒的風(fēng)險(xiǎn)[11]。代謝組學(xué)檢測(cè)可以反映生物體、器官和細(xì)胞的內(nèi)在或外在相互作用，胚胎培養(yǎng)液的氨基酸代謝作為評(píng)價(jià)胚胎發(fā)育和預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局的參考指標(biāo)，已經(jīng)越來(lái)越多地見(jiàn)諸于輔助生殖領(lǐng)域研究中。研究者發(fā)現(xiàn)在校正其它混雜因素后，胚胎培養(yǎng)液中甘氨酸和丙氨酸濃度仍與妊娠結(jié)局呈負(fù)相關(guān)，提示兩者與胚胎活力有關(guān)[8]。通過(guò)數(shù)學(xué)建模表明，絲氨酸、天冬氨酸、組氨酸和丙氨酸的氨基酸色譜圖峰高和峰面積組合對(duì)于妊娠組和非妊娠組的預(yù)測(cè)率分別達(dá)到82.7%和95.7%[12]。卵泡液的氨基酸代謝組學(xué)變化也可為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者提供診斷依據(jù)和治療靶點(diǎn)[13]。已發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者血液賴氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、組氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸顯著增加，這些氨基酸代謝物的改變可能與過(guò)度炎癥反應(yīng)和血管功能障礙有關(guān)，從而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性差[14]。然而，血液氨基酸譜的變化如何影響IVF妊娠結(jié)局尚未確定。本研究結(jié)果提示女性血液中瓜氨酸的濃度與IVF妊娠結(jié)局呈負(fù)相關(guān)，絲氨酸的濃度與IVF妊娠結(jié)局呈正相關(guān)。

瓜氨酸是一種非必需氨基酸，由小腸中的谷氨酰胺和脯氨酸內(nèi)源性轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。瓜氨酸在腎臟中被吸收并轉(zhuǎn)化為精氨酸，然后釋放到全身血液中[15]。在瓜氨酸轉(zhuǎn)化為精氨酸的過(guò)程中，一氧化氮合酶介導(dǎo)了血管擴(kuò)張劑一氧化氮的生成。正常妊娠過(guò)程中，由子宮動(dòng)脈內(nèi)皮合成的一氧化氮可增加通過(guò)動(dòng)脈的血流量，以滿足胎兒日益增長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求。妊娠期過(guò)量飲酒可影響瓜氨酸生物合成和代謝相關(guān)的特定途徑，可能是酒精誘導(dǎo)的子宮動(dòng)脈功能障礙的潛在機(jī)制[16]。我們推測(cè)在胚胎植入階段，較低濃度的母體瓜氨酸可能通過(guò)調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的血流影響胚胎的著床過(guò)程。絲氨酸也是一種非必需氨基酸，是糖酵解途徑的中間產(chǎn)物。絲氨酸具有多種有益作用，它是大腦功能和發(fā)育的重要營(yíng)養(yǎng)素，能促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)[17]。一項(xiàng)隨訪4年的隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，血液絲氨酸水平與代謝綜合征的發(fā)展和血脂異常呈負(fù)相關(guān)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)絲氨酸具有有益妊娠的作用，與這些前期報(bào)道相符。一項(xiàng)針對(duì)反復(fù)種植失敗女性的血液代謝物分析亦發(fā)現(xiàn)精氨酸代謝途徑受損[19]，提示我們有必要深入探索精氨酸代謝途徑調(diào)控胚胎植入的具體分子機(jī)制，從而為一些不明原因妊娠失敗患者提供新的治療靶點(diǎn)。

此外，本研究尚存在一些不足之處，有待未來(lái)在大樣本研究中進(jìn)一步改進(jìn)：(1)本研究納入的對(duì)象為所有的驗(yàn)孕患者，應(yīng)設(shè)立嚴(yán)格的排除標(biāo)準(zhǔn)，保證研究人群的均一性，從而明確影響血液氨基酸水平的相關(guān)因素；(2)研究的樣本量較小，無(wú)法得出瓜氨酸或絲氨酸濃度作為預(yù)測(cè)IVF妊娠結(jié)局的臨界值。