張丹，孫大光，3，張璐，馬旭*，夏紅飛*

(1.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所遺傳優(yōu)生中心，北京 100081；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；3.重慶市人口和計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院，重慶 400020)

低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)是一種轉(zhuǎn)錄因子，它參與細(xì)胞對(duì)低氧的適應(yīng)性生理反應(yīng)，包括免疫細(xì)胞激活、增殖和凋亡等[1-3]。HIF家族在大多數(shù)脊椎動(dòng)物中有3個(gè)不同的成員，即HIF-1、HIF-2和HIF-3，均由α和β兩個(gè)亞基組成，屬于基本螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)-下游鐘基因-芳香烴受體核轉(zhuǎn)位子-專一性蛋白結(jié)構(gòu)域(per-arnt-sim，PAS)超家族成員，其中α亞基是調(diào)節(jié)HIF活性的功能亞基[4]。與HIF-1和HIF-2[5]相比，對(duì)HIF-3的研究較少。最初由Gu等[4]在1998年發(fā)現(xiàn)小鼠低氧誘導(dǎo)因子-3α(hypoxia inducible factor-3α，mHIF-3α)，2001年Hara等[6]發(fā)現(xiàn)了人類HIF-3α。人HIF-3、HIF-1、HIF-2的α亞基中的bHLH及PAS區(qū)高度相似，但HIF-3的α亞基C端缺乏轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)；此外，HIF-3α能抑制人腎臟中由HIF介導(dǎo)的低氧誘導(dǎo)基因的表達(dá)，它可能是低氧期間基因表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)器[6]。有研究發(fā)現(xiàn)HIF-3α是一個(gè)氧依賴的轉(zhuǎn)錄激活因子，它的轉(zhuǎn)錄激活作用是保守的，如人HIF-3α-1和HIF-3α-9能上調(diào)相似的基因[7]。HIF-3α是在生理和病理?xiàng)l件下對(duì)人類低氧反應(yīng)進(jìn)行微調(diào)的一個(gè)重要因子[8]。低氧能迅速激活HIF-3的表達(dá)[9]，同時(shí)，低氧也可引起胎盤功能減退或老化，但HIF-3α對(duì)胎盤細(xì)胞是否有影響目前尚不清楚。在本研究中，我們以HTR8/SVneo細(xì)胞系作為研究對(duì)象，我們?cè)O(shè)計(jì)HIF-3α的過表達(dá)和敲低的實(shí)驗(yàn)，探究HIF-3α對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞在增殖和凋亡、遷移和浸潤等方面的影響，從而預(yù)測(cè)它在胎盤中的作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料和試劑

1.細(xì)胞株：人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞(HTR8/SVneo細(xì)胞)由中國科學(xué)院動(dòng)物研究所王雁玲和王紅梅老師贈(zèng)送。

2.主要試劑與儀器：pcDNA3.1(+)質(zhì)粒(Thermo Fisher Scientific，美國)；HIF-3α抑制物(scramble siRNA、HIF-3αsiRNA #1、HIF-3αsiRNA #2和HIF-3αsiRNA #3)購自上海吉瑪生物公司；MTT(Sigma-Aldrich，美國)；Cell-Light EdU Apollo643 In Vitro Imaging Kit試劑盒購自廣州銳博生物；Annexin V/PI試劑盒(Invitrogen，美國)；兔抗HIF-3α多克隆抗體(Genetex，美國)；小鼠抗β-ACTIN單克隆抗體(Abcam，美國)，辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗兔和羊抗小鼠IgG二抗購自北京中杉金橋；Synergy2 多功能酶標(biāo)儀(Biotek，美國)；TE2000-U倒置熒光相差顯微鏡(尼康，日本)；流式細(xì)胞儀(Beckman coulter，德國)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.載體構(gòu)建：由生工生物工程(上海)股份有限公司合成人HIF-3α的編碼序列(Coding domain sequence，CDS)，并插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，即獲得HIF-3α表達(dá)載體pcDNA3.1-HIF-3α。

2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：實(shí)驗(yàn)分為pcDNA3.1組、pcDNA3.1-HIF-3α組、scramble siRNA組和HIF-3αsiRNA組(從HIF-3αsiRNA #1、HIF-3αsiRNA #2和HIF-3αsiRNA #3抑制劑中篩選最佳抑制劑供HIF-3αsiRNA組使用)，其中pcDNA3.1組是pcDNA3.1-HIF-3α組的陰性轉(zhuǎn)染組，scramble siRNA組是HIF-3αsiRNA組的陰性轉(zhuǎn)染組。將HTR8/SVneo細(xì)胞接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，各組按照下表1進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染 24 h后，根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分別接種于不同的孔板中。

表1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染加樣量情況

3.MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力：細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，以每孔5 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，再過24 h加入20 μl 5 mg/ml MTT，避光孵育4 h后棄上清，加入200 μl二甲基亞砜，10 min后檢測(cè)樣品在A570 nm處的吸光度。為了避免組內(nèi)誤差設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔；為了降低實(shí)驗(yàn)誤差和批間差異，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。MTT=實(shí)驗(yàn)組A570 nm/對(duì)照組A570 nm×100%。

4.EdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖：細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，以每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種于24孔板。24 h后根據(jù)EdU試劑盒說明書，用細(xì)胞培養(yǎng)基按照1 000∶1的比例稀釋EdU溶液，EdU終濃度為50 μmol/L。細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入200 μl EdU培養(yǎng)基，37℃ 孵育2 h，棄培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，然后每孔加入200 μl 1×Apollo染色液，室溫孵育30 min，最后每孔加入200 μl 1×Hoechst33342反應(yīng)液孵育30 min進(jìn)行DNA染色。顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)視野下EdU標(biāo)記的紅色熒光細(xì)胞數(shù)和Hoechst33342標(biāo)記的藍(lán)色熒光細(xì)胞總數(shù)，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。細(xì)胞增殖率=EdU標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)/Hoechst33342標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)×100%。

5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，以每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種于24孔板。24 h后根據(jù)Annexin V/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒說明書，用2.5 μl AnnexinV-FITC儲(chǔ)液和5μl 20 μg/ml磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol，PI)混勻后加入每組的細(xì)胞懸液中，避光室溫孵育15 min，用流式細(xì)胞儀對(duì)標(biāo)本進(jìn)行定量分析，每管共檢測(cè)8 000個(gè)細(xì)胞。每組設(shè)置2個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)依據(jù)不同功能狀態(tài)下細(xì)胞對(duì)染料的吸收作用不同分別采集到早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞的熒光信號(hào)，檢測(cè)得到的二維散點(diǎn)圖的4個(gè)象限分別代表不同狀態(tài)的細(xì)胞，左上方區(qū)域的細(xì)胞為壞死細(xì)胞，右上方區(qū)域的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞，右下方區(qū)域的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，左下方區(qū)域的細(xì)胞為活細(xì)胞。

6.細(xì)胞培養(yǎng)小室(Transwell)法檢測(cè)細(xì)胞浸潤和遷移能力：在細(xì)胞遷移的檢測(cè)中，用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度為 0.5×109個(gè)/L，將100 μl細(xì)胞懸液移入小室中，在下室里添加600 μl的培養(yǎng)基(內(nèi)含2.5%胎牛血清)，18 h后加入結(jié)晶紫染色液染色10 min。在細(xì)胞浸潤的檢測(cè)中，Transwell小室上有稀釋的基質(zhì)膠(1∶3)，加入含0.5×105個(gè)/L的細(xì)胞懸液，12 h后用結(jié)晶紫進(jìn)行染色，鏡下觀察細(xì)胞。任意取5個(gè)視野(目鏡20×)記錄細(xì)胞的總數(shù)，每組重復(fù)3次。

7.蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)：各組細(xì)胞提取蛋白后，取60 μg蛋白在裂解液變性后，經(jīng)10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳達(dá)分離，然后轉(zhuǎn)膜(硝酸纖維素膜)，室溫下用5%脫脂奶粉孵育1 h，依次與1∶1 000稀釋的一抗(兔抗HIF-3α多克隆抗體和小鼠抗β-ACTIN單克隆抗體)和1∶10 000稀釋的二抗(HRP標(biāo)記的羊抗兔和羊抗小鼠IgG)均室溫孵育1 h，最后，用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯色、曝光。利用Image J軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值。β-actin為內(nèi)參，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、HIF-3α的過表達(dá)和敲低實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證結(jié)果

Western Blot分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1- HIF-3α質(zhì)粒和HIF-3αsiRNA的HTR8/SVneo細(xì)胞中HIF-3α的表達(dá)水平，結(jié)果顯示pcDNA3.1- HIF-3α的過表達(dá)是有效的(P<0.05)，而且HIF-3αsiRNA的敲低也是高效的(P<0.05)，HIF-3αsiRNA #1、HIF-3αsiRNA #2和HIF-3αsiRNA #3的敲低效率分別是60.0%、66.6%和50.1%(圖1)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用HIF-3αsiRNA #2作為HIF-3αsiRNA組處理HTR8/SVneo細(xì)胞。

A：Western Blot檢測(cè)pcDNA3.1- HIF-3α質(zhì)粒在HTR8/SVneo細(xì)胞中的表達(dá)；B：Western Blot檢測(cè)HIF-3α siRNA在HTR8/SVneo細(xì)胞中的表達(dá)；C：過表達(dá)HIF-3α的Western Blot檢測(cè)結(jié)果灰度分析，與pcDNA3.1組比較，*P<0.05；D：敲低HIF-3α的Western Blot檢測(cè)結(jié)果灰度分析，與scramble siRNA組比較，*P<0.05圖1 過表達(dá)和敲低HIF-3α結(jié)果

二、HIF-3α對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞活性和細(xì)胞增殖的影響

EdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖發(fā)現(xiàn)，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-HIF-3α處理組細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)(P<0.05)；與scramble siRNA組相比，HIF-3αsiRNA處理組細(xì)胞增殖顯著降低(P<0.05)(圖2)。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性發(fā)現(xiàn)，與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-HIF-3α組細(xì)胞活力無顯著差異(P>0.05)；與scramble siRNA組比較，HIF-3αsiRNA組細(xì)胞的細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05)(圖3)。

三、HIF-3α對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HIF-3α過表達(dá)有降低HTR8/SVneo細(xì)胞早期凋亡的趨勢(shì)，但無顯著差異(P>0.05)；HIF-3α敲低后細(xì)胞凋亡無顯著差異(P>0.05)(圖4)。

A：EdU熒光成像圖(陽性細(xì)胞是紅色熒光，DAPI復(fù)染細(xì)胞核是藍(lán)色熒光，Merge是EdU和DAPI的熒光成像合成圖像)(×200)；B：過表達(dá)HIF-3α對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞增殖的影響，與pcDNA3.1組比較，*P<0.05；C：敲低HIF-3α對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞增殖的影響，與scramble siRNA組比較，*P<0.05圖2 HIF-3α對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞增殖的影響

A：過表達(dá)HIF-3α對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞活力的影響；B：敲低HIF-3α對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞活力的影響；與scramble siRNA組比較，*P<0.05圖3 HIF-3α對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞活力的影響

A：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過表達(dá)HIF-3α對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞凋亡的影響；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)敲低HIF-3α對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞凋亡的影響；C：過表達(dá)HIF-3α對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡的影響；D：敲低HIF-3α對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡的影響圖4 HIF-3α對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞凋亡的影響

四、HIF-3α對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞遷移和浸潤能力的影響

Transwell小室法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HIF-3α過表達(dá)處理后細(xì)胞的計(jì)數(shù)顯著升高(P<0.05)，即HIF-3α過表達(dá)可促進(jìn)HTR8/SVneo細(xì)胞的浸潤和遷移能力；而HIF-3α敲低處理后細(xì)胞的計(jì)數(shù)顯著降低(P<0.05)，即HIF-3α敲低可降低HTR8/SVneo細(xì)胞的浸潤和遷移能力(圖5和圖6)。

A：Transwell法檢測(cè)HIF-3α對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞遷移影響的染色圖(×200)；B：HIF-3α過表達(dá)的Transwell結(jié)果柱形圖分析，與pcDNA3.1組比較，*P<0.05；C：敲低HIF-3α的Transwell結(jié)果柱形圖分析，與scramble siRNA組比較，*P<0.05圖5 HIF-3α對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞遷移的影響

A：Transwell法檢測(cè)HIF-3α對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞浸潤影響的染色圖(×200)；B：HIF-3α過表達(dá)的Transwell結(jié)果柱形圖分析，與pcDNA3.1組比較，*P<0.05；C：敲低HIF-3α的Transwell結(jié)果柱形圖分析，與scramble siRNA組比較，*P<0.05圖6 HIF-3α對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞浸潤的影響

討 論

氧是哺乳動(dòng)物新陳代謝和生理功能中必不可少的條件之一，它在細(xì)胞能量產(chǎn)生和許多酶的輔助因子/底物中扮演著重要角色。機(jī)體在有氧條件下，HIFα與希佩爾-林道蛋白(von hippel-lindau，VHL)蛋白相互作用并結(jié)合，從而激活泛素連接酶系統(tǒng)，導(dǎo)致HIFα的蛋白酶體降解。低氧時(shí)，HIFα表達(dá)穩(wěn)定并與HIFβ相結(jié)合形成二聚體，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與低氧應(yīng)答元件(HREs)結(jié)合，參與調(diào)控低氧基因表達(dá)[9]。HIF可以激活控制細(xì)胞氧穩(wěn)態(tài)的基因，包括與氧消耗、紅細(xì)胞生成、血管生成和線粒體代謝有關(guān)的基因。低氧細(xì)胞通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后機(jī)制應(yīng)對(duì)低氧環(huán)境的影響，這主要受HIF調(diào)控[10]。低氧會(huì)使HIF-3αmRNA表達(dá)水平升高[11]。已有研究發(fā)現(xiàn)大鼠在低氧環(huán)境下，在肺和其他器官中HIF-3αmRNA表達(dá)水平顯著增加[12-14]。低氧條件下斑馬魚中HIF-3αmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平也會(huì)升高[15]。本實(shí)驗(yàn)中，我們通過HIF-3α在HTR8/SVneo細(xì)胞中過表達(dá)和敲低的實(shí)驗(yàn)可知，它的表達(dá)水平對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞的增殖、活力、遷移和浸潤功能均有影響。并且HIF-3α的過表達(dá)對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞的遷移和浸潤能力、細(xì)胞增殖都有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)。而細(xì)胞的增殖、遷移、浸潤等功能在胚胎組織器官發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用，我們認(rèn)為HIF-3α可能參與胎盤在胚胎發(fā)育中的調(diào)控過程。HIF-3α基因的表達(dá)是通過HIF-1α和HIF-2α誘導(dǎo)的[16-17]。因此，HIF-3α基因產(chǎn)物可能在低氧誘導(dǎo)基因表達(dá)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。目前對(duì)HIF-3α的作用尚未完全了解，長期以來人們一直認(rèn)為它與HIF-1α和HIF-2α的表達(dá)負(fù)相關(guān)，并直接或間接調(diào)節(jié)低氧誘導(dǎo)的病理過程[19]。我們發(fā)現(xiàn)HIF-3α敲低對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞的遷移和浸潤能力、細(xì)胞增殖有很顯著的抑制作用(P<0.05)，但對(duì)細(xì)胞活力有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)，對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞早期凋亡的影響無顯著差異(P>0.05)?？傊?，HIF-3α過表達(dá)或敲低都對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞的增殖、遷移和浸潤能力有顯著影響(P<0.05)，說明HIF-3α是調(diào)節(jié)HTR8/SVneo細(xì)胞增殖、遷移和浸潤能力的重要因子。

HIF-3是一種氧依賴性轉(zhuǎn)錄因子，它可以通過調(diào)控其下游的基因[20]激活應(yīng)對(duì)缺氧的獨(dú)特轉(zhuǎn)錄反應(yīng)[7]。已有的研究證明HIF-3α除了低氧環(huán)境的應(yīng)激調(diào)控外、在糖代謝中也發(fā)揮作用[21]。我們推測(cè)它參與胎盤某些重要功能(如內(nèi)分泌功能與浸潤功能等)的過程，那么也可能在妊娠中多種疾病的發(fā)生過程有著重要的調(diào)控作用。