王允虎，趙曉紅，王成忠

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，濟(jì)南 250353)

谷胱甘肽(GSH)是一種由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸組成的三肽化合物，在自然界中普遍存在[1]。目前，大多數(shù)的谷胱甘肽是以還原型谷胱甘肽存在，氧化型谷胱甘肽較少。谷胱甘肽具有較高的醫(yī)用價值與食用價值，并且在化工與保健品領(lǐng)域應(yīng)用甚廣[2]。在食品領(lǐng)域，谷胱甘肽對無機(jī)鹽有增味效果[3]。谷胱甘肽對人體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)有著極為重要的意義，因其具有消減毒素、抗腫瘤與減緩衰老等作用而備受青睞。目前學(xué)者們對谷胱甘肽的研究領(lǐng)域非常廣泛，國外對谷胱甘肽的研究主要在生物與檢測方面，如Daniela Giustarini等曾研究N-乙酰半胱氨酸乙酯作為谷胱甘肽增強(qiáng)劑在人原發(fā)性內(nèi)皮細(xì)胞中的應(yīng)用，Buchtova Zaneta等的研究利用了電化學(xué)檢測毛細(xì)血管中的谷胱甘肽[4-5]。國內(nèi)對谷胱甘肽的研究在醫(yī)學(xué)與提取方面較多，就醫(yī)學(xué)方面而言，陳亮等研究了谷胱甘肽對小鼠肝損傷防護(hù)的影響，彭春媛等學(xué)者研究了谷胱甘肽的合成代謝對早產(chǎn)兒腦損傷的影響[6-7]。就提取方面而言，李雙石等研究了乙醇提取法提取葡萄酒廢酵母中的谷胱甘肽[8]。但是在提取方面，大多數(shù)學(xué)者只停留在傳統(tǒng)的酵母細(xì)胞發(fā)酵法以及對此方法的條件優(yōu)化，運(yùn)用輔料制備新型酵母細(xì)胞培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法還很少。

玉米胚粕是玉米胚芽經(jīng)過提油或蛋白后的副產(chǎn)物，因其中纖維含量較高，口感較差，大部分玉米胚粕只是作用于動物飼料方面[9]。玉米黃漿是玉米淀粉加工后的副產(chǎn)物，在加工完淀粉后大多數(shù)的玉米黃漿被當(dāng)作廢水處理掉。玉米胚粕與玉米黃漿在發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽方面有著較好的應(yīng)用價值，玉米胚粕中碳水化合物的含量可以達(dá)到45%～55%，可以為酵母菌提供碳源，玉米黃漿也可以為微生物發(fā)酵提供碳源[10]。玉米胚粕與玉米黃漿的優(yōu)良特性為制作新型發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的培養(yǎng)基奠定了基礎(chǔ)，從而實(shí)現(xiàn)了資源的二次利用，降低了生產(chǎn)成本，有效提高了經(jīng)濟(jì)效益。

本研究利用糖化且經(jīng)過三效濃縮后的玉米胚粕與玉米黃漿混合物為原料，制作了一種新型培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽。運(yùn)用單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)確定培養(yǎng)基配方與最佳發(fā)酵工藝條件。采用琥珀酸二酯磺酸鈉與異辛烷對谷胱甘肽進(jìn)行反膠團(tuán)萃取，經(jīng)過超濾與低溫冷凍干燥后得到谷胱甘肽成品，并求得谷胱甘肽產(chǎn)量，為谷胱甘肽的提取方法提供了理論依據(jù)與技術(shù)支持。

1 材料儀器與方法

1.1 材料

采用提取蛋白后的玉米胚粕與加工玉米淀粉后的玉米黃漿混合物為原料，釀酒酵母選取S.cerevisiaeL5267，實(shí)驗(yàn)藥品見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)藥品清單Table 1 The list of experimental drugs

1.2 儀器與設(shè)備

MT小型紫銅糖化罐、FR124CN型電子分析天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司；HY-4/5往復(fù)式振蕩器、SW-CJ-2FD超凈工作臺、Minimate TF納濾膜分離設(shè)備、Scientz-10ND低溫冷凍干燥機(jī)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)得到的指標(biāo)數(shù)據(jù)，運(yùn)用Origin與SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)對比與分析。

1.4 方法

1.4.1 玉米胚粕與玉米黃漿的濃縮

將玉米胚粕與玉米黃漿經(jīng)過液化、糖化與三效濃縮提高糖濃度，條件如下：

液化與糖化：將玉米胚粕與玉米黃漿按1∶1混合，調(diào)整淀粉濃度在30%～35%之間，利用蒸汽噴射器在0.3～0.5 MPa下進(jìn)行液化。將液化液轉(zhuǎn)入糖化罐進(jìn)行糖化，控制糖化酶添加量在90～110 U/g之間。

三效濃縮：一效蒸發(fā)溫度70～80 ℃，二效蒸發(fā)溫度65～73 ℃，三效蒸發(fā)溫度47～55 ℃，出料濃度45%～55%，濃縮后測定DE值大于90。

1.4.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化

分別對DE值、L-cys、KCl和肌醇添加量進(jìn)行單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)，研究其對谷胱甘肽合成的影響。

1.4.3 谷胱甘肽提取方法

利用琥珀酸二酯磺酸鈉與異辛烷對發(fā)酵液進(jìn)行反膠團(tuán)萃取，以7 mmol/L Aliquat 366為表面活性劑，調(diào)節(jié)萃取原料液水相pH為2.5，K+濃度為0.2 mol/L，反膠束與萃取原料液水相的體積比為2∶1，萃取時間為15 min。

萃取完畢后利用NaCl溶液進(jìn)行反萃取，NaCl為1.3 mol/L，萃取溫度為20 ℃，pH為6.1，反萃取完畢后檢測萃取液中谷胱甘肽含量，之后將萃取液進(jìn)行超濾與低溫冷凍干燥得到固體谷胱甘肽。

2 結(jié)果

2.1 DE值對酵母菌發(fā)酵的影響

玉米胚粕與玉米黃漿進(jìn)行糖化時，通過調(diào)節(jié)糖化酶的添加量來控制最終濃縮液的DE值，不同的DE 值對S.cerevisiaeL5267酵母菌生長影響見圖1。

圖1 DE值對酵母菌發(fā)酵數(shù)量的影響Fig.1 Effect of DE values on fermentation quantity of yeast

由圖1可知，DE值在89～92之間時，酵母菌發(fā)酵數(shù)量隨著DE值的增大而增大。DE值為89時，酵母菌發(fā)酵后數(shù)量為6.15×109CFU/mL。DE值為92時，酵母菌發(fā)酵數(shù)量達(dá)到最大值8.72×109CFU/mL。而進(jìn)一步將DE值提高到93時，酵母菌發(fā)酵數(shù)量減少到7.32×109CFU/mL，原因是糖濃度較高時會增強(qiáng)酵母菌的滲透壓，導(dǎo)致失水嚴(yán)重，會使其發(fā)生質(zhì)壁分離，從而降低了酵母菌的成活率。因此，當(dāng)玉米胚粕與玉米黃漿DE值為92時，最有利于酵母菌的繁殖。

2.2 培養(yǎng)基成分單因素試驗(yàn)

2.2.1 L-cys對發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的影響

以250 mL液體培養(yǎng)基為準(zhǔn)，發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽時調(diào)節(jié)L-cys添加量為0.3，0.35，0.4， 0.45，0.5 g，得到發(fā)酵液經(jīng)過反膠團(tuán)萃取后谷胱甘肽產(chǎn)量，見圖2。

圖2 L-cys添加量對生產(chǎn)谷胱甘肽的影響Fig.2 Effect of L-cys additive amount on glutathione production

由圖2可知，當(dāng)L-cys添加量為0.4 g時，發(fā)酵生產(chǎn)出的谷胱甘肽含量最高，達(dá)到了8.218 mg/g。當(dāng)繼續(xù)增加L-cys添加量時，谷胱甘肽產(chǎn)量開始降低。添加量為0.5 g時，谷胱甘肽含量降到了7.843 mg/g，產(chǎn)量減少了4.5%。其原因是L-cys作為合成谷胱甘肽的前體物質(zhì)，合成時需要消耗ATP，當(dāng)ATP不足時會抑制L-cys的作用，從而降低谷胱甘肽的產(chǎn)量。

2.2.2 肌醇對發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的影響

以250 mL液體培養(yǎng)基為準(zhǔn)，發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽時調(diào)節(jié)肌醇添加量為0.0355，0.0365，0.0375，0.0385，0.0395 g，得到發(fā)酵液經(jīng)過反膠團(tuán)萃取后，谷胱甘肽產(chǎn)量，見圖3。

由圖3可知，當(dāng)肌醇添加量為0.0375 g時，發(fā)酵生產(chǎn)出的谷胱甘肽含量最高，達(dá)到了8.365 mg/g。當(dāng)繼續(xù)增加L-cys添加量時，谷胱甘肽產(chǎn)量開始降低。當(dāng)肌醇添加量為0.0395 g時，谷胱甘肽產(chǎn)量達(dá)到最低7.708 mg/g，產(chǎn)量減少了7.8%。在發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽時，肌醇在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起到重要作用，而且也可以幫助許多活性物質(zhì)發(fā)揮作用。但培養(yǎng)基中添加肌醇過多時會出現(xiàn)析出的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致谷胱甘肽的產(chǎn)量有所降低。

圖3 肌醇添加量對生產(chǎn)谷胱甘肽的影響Fig.3 Effect of inositol additive amount on glutathione production

2.2.3 K+對發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的影響

以250 mL液體培養(yǎng)基為準(zhǔn)，發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽時調(diào)節(jié)K+濃度為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol/L，得到發(fā)酵液經(jīng)過反膠團(tuán)萃取后谷胱甘肽產(chǎn)量，見圖4。

圖4 K+濃度對生產(chǎn)谷胱甘肽的影響Fig.4 Effect of K+ concentration on glutathione production

由圖4可知，當(dāng)培養(yǎng)基中K+濃度達(dá)到0.2 mol/L時，谷胱甘肽含量最高，可達(dá)到9.127 mg/g，之后隨著K+濃度增加，谷胱甘肽含量隨之降低。當(dāng)K+濃度為0.5 mol/L時，谷胱甘肽生產(chǎn)量達(dá)到最低8.579 mol/L，生產(chǎn)量降低了6.0%。K+可以提高酵母細(xì)胞的通透性，從而提高其發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的效率，但當(dāng)K+濃度過高時會影響酵母細(xì)胞的滲透壓，因此降低了谷胱甘肽的生產(chǎn)量[11]。

2.3 正交試驗(yàn)

為確定新型培養(yǎng)基最佳成分配比，對培養(yǎng)基中L-cys、肌醇、K+添加量以及玉米胚粕與玉米黃漿混合物的DE值進(jìn)行正交試驗(yàn)L9(34)，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 The factors and levels of orthogonal experiment

由表3可知，R1>R3>R4>R2，即培養(yǎng)基中各個成分對發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的影響順序?yàn)橛衩着咂膳c玉米黃漿混合物的DE值>肌醇添加量>K+添加量>L-cys添加量。最優(yōu)發(fā)酵條件組合為A2B3C1D2，當(dāng)玉米胚粕與玉米黃漿混合物的DE值為92，肌醇添加量為0.0370 g，L-cys添加量為0.45 g，K+添加量為0.2 g時，經(jīng)過琥珀酸二脂磺酸鈉萃取后谷胱甘肽生產(chǎn)量最高達(dá)到了10.01 mg/g。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of orthogonal experiment

由表4方差分析結(jié)果中F比可知，玉米胚粕與玉米黃漿的DE值對發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的影響有顯著性(F比>F臨界值)，其他因素并沒有達(dá)到顯著水平

表4 方差分析結(jié)果Table 4 The results of variance analysis

3 討論

研究可知，新型培養(yǎng)基配比為L-cys 0.4 g、肌醇 0.0375 g、K+0.2 mol/L、玉米胚粕與玉米黃漿糖化液100 g(DE值92)、蒸餾水150 g。在此條件下，谷胱甘肽產(chǎn)量達(dá)到10.01 mg/g。

通過研究新型培養(yǎng)基的成分配比可知，玉米胚粕與玉米黃漿的DE值是決定發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽產(chǎn)量的主要因素。適當(dāng)DE值可以為酵母菌提供充足的ATP以及維持適當(dāng)?shù)臐B透壓，為酵母菌提供良好的發(fā)酵環(huán)境，可作為培養(yǎng)基的優(yōu)良碳源。而L-cys、肌醇與K+則輔助酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)，優(yōu)化其發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)境，影響效果要低于玉米胚粕與玉米黃漿[12]。

與常見發(fā)酵方法相比，將玉米胚粕與玉米黃漿作為碳源制作發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的培養(yǎng)基具有較高的生產(chǎn)效率。普通酵母菌培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽產(chǎn)量大約在7.83 mg/g，而本研究谷胱甘肽產(chǎn)量達(dá)到了10.01 mg/g[13]。玉米胚粕與玉米黃漿價格低廉，可降低谷胱甘肽的生產(chǎn)成本，并且使得玉米胚粕廢料得到了二次利用。我國是玉米與小麥的種植大國，且玉米胚中含有豐富的谷胱甘肽，將其用作原材料發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽有著重要的社會價值與經(jīng)濟(jì)效益[14]。