李莎莎,李 露,吳 璞,郝亞寧

(1西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，西安 710077；2西安市第九醫(yī)院腎內(nèi)科；3西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:haoynhaoyn@163.com)

尿酸(uric acid，UA)是人類嘌呤代謝的終產(chǎn)物，由于尿酸氧化酶在人類長期進化過程中發(fā)生基因突變不能將尿酸氧化為尿囊素，故人類嘌呤代謝的最終產(chǎn)物僅為尿酸，且主要經(jīng)腎臟排泄[1]。因此研究高尿酸血癥與腎臟損害的關(guān)系具有至關(guān)重要的臨床和實際意義。近年來國內(nèi)外大量研究[2]表明高尿酸與腎臟的關(guān)系不僅僅是引起腎小管-間質(zhì)尿酸結(jié)晶形成、間質(zhì)炎性細胞浸潤等慢性間質(zhì)性腎炎的形態(tài)學(xué)變化，更重要的是尿酸可參與腎小球內(nèi)“高壓力、高灌注、高濾過”，引起炎癥反應(yīng)、血管病變及腎小球固有細胞損傷并由此誘發(fā)和加重腎臟損害。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)尿酸可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞增殖及表型轉(zhuǎn)化[3]。α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)是腎小球系膜細胞表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志蛋白。腎小球系膜細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化過程中，系膜細胞發(fā)生了形態(tài)學(xué)、細胞骨架結(jié)構(gòu)和功能的改變?？偟陌ㄒ韵氯矫妫盒螒B(tài)學(xué)變化就是細胞從緊密融合的不規(guī)則形轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形的典型肌成纖維細胞形態(tài)；肌纖維母細胞的典型標(biāo)志α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)大量表達；分泌大量細胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)等及細胞外基質(zhì)成分如纖維連接蛋白(fibronectin)等。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)是細胞整合多條信號通路，調(diào)節(jié)生理或病理反應(yīng)的重要途徑之一，可決定細胞增殖、分化、凋亡等命運[4]。故可能在尿酸引起系膜細胞表型轉(zhuǎn)化過程中起重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)作為多功能調(diào)節(jié)劑,當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于穩(wěn)態(tài)時,GRP78能結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上未折疊蛋白堆積的感受器蛋白的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)端，維持信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的非活化狀態(tài)。蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disul-fide isomerase,PDI)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中含量最豐富的蛋白質(zhì)之一,它是促進蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中二硫鍵形成的蛋白酶。當(dāng)PDI減少時,錯誤折疊的蛋白質(zhì)增多且細胞凋亡程序啟動,促進細胞死亡。

4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)是通過化學(xué)合成的,具伴侶活性的小分子質(zhì)量脂肪酸,能穩(wěn)定蛋白構(gòu)象,改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊蛋白能力,減輕ERS反應(yīng)的發(fā)生。故推測4-PBA可能對NAFLD具有潛在的保護作用。本研究動態(tài)觀察在高尿酸環(huán)境下，大鼠腎小球系膜細胞表型轉(zhuǎn)化情況和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生情況,以期明確尿酸誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用并初步闡明其機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

大鼠腎小球系膜細胞(HBZY-1)購自中國典型物保藏中心，DMEM培養(yǎng)基，尿酸、4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid，4-PBA)及毒胡蘿卜素(thapsigargin)購自美國Sigma公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR引物購自中國大連Takara寶生物工程有限公司,PCR擴增儀、凝膠成像分析儀均購自Bio-Rad公司。TECNAI G2 F30 S-Twin型透射電鏡購自荷蘭Philips-FEI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 大鼠腎小球系膜細胞(HBZY-1)貼壁培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于5%CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細胞狀態(tài)及生長速度決定換液時間，一般2-3 d更換一次培養(yǎng)基，待貼壁細胞長至80%-90%融合時，以0.25%胰酶和0.02%EDTA消化傳代，選擇對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 實驗分組 毒胡蘿卜素(thapsigargin)是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)劑，為驗證尿酸可誘導(dǎo)HBZY-1發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，將細胞隨為：control組，thapsigargin(0.25 μmol/L)組，UA(0.2 mmol/L)組。為進一步檢測不同濃度組尿酸作用HBZY-1不同時間對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)GRP78、PDI的影響，將細胞隨機分為不同濃度尿酸組(0.05，0.1，0.2，0.4 mmol/L)作用48 h；再應(yīng)用尿酸(0.2 mmol/L)分別作用24，36，48 h。為檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)抑制劑4-PBA的干預(yù)作用，將細胞隨機分為control組，control+4-PBA(0.25 μmol/L)組，UA(0.2 mmol/L)組，UA+4-PBA組(0.25 μmol/L 4-PBA預(yù)處理HBZY-1細胞6 h，加入0.2 mmol/L尿酸干預(yù)48 h)。

1.2.3 細胞一般形態(tài)觀察 分別在倒置顯微鏡及透射電鏡下分別觀察control組、control+4-PBA(0.25 μmol/L)組、UA(0.2 mmol/L)組和4-PBA+UA組細胞形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)變化，并拍照采集圖片。

1.2.4 RT-PCR檢測GRP78、PDI 嚴格按RNAfast200總RNA極速抽提試劑盒說明提取細胞總RNA并行定量及純度鑒定。逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴增反應(yīng)體系25 μl，上下游引物均由大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)設(shè)計合成(見表1)，反應(yīng)條件如下：預(yù)變性：94 ℃，30 s；變性：95 ℃，30 s；退火：55-65 ℃，30 s；延伸：72 ℃，30 s，共30個循環(huán)，每組重復(fù)6次，擴增結(jié)束后即可置于微量離心機上3 000 r/min，離心30 s，可用于瓊脂糖凝膠電泳。在Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)中拍照，并用自帶軟件對結(jié)果進行灰度分析，計算各項指標(biāo)灰度值與內(nèi)參β-actin的灰度值之比代表其相對強度。

1.2.5 Western Blot法檢測GRP78、PDI、α-SMA、TGF-β1及Fn 按試劑盒說明書提取細胞總蛋白并測定濃度。進行聚丙烯酰胺凝聚電泳，半干轉(zhuǎn)移法降蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用5%脫脂奶粉配制一抗，本實驗中α-SMA、TGF-β1、Fironectin、GRP78、PDI及β-actin一抗的稀釋度依次為1 ∶400，1 ∶250，1 ∶1 000，1 ∶400，1 ∶400，1 ∶400。4 ℃孵化1 h，TBST液洗滌3次，用5%脫脂奶粉配制二抗，按1 ∶15 000稀釋，加入二抗室溫孵化1 h后，通過Western blot曝光觀察，測定各蛋白表達量。

表1 RT-PCR各引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 尿酸可誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)

Western blot印跡顯示，0.25 μmol/L毒胡蘿卜素及0.2 mmol/L尿酸作用于HBZY-1細胞48 h，均可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)標(biāo)志性指標(biāo)GRP78,PDI蛋白表達增加，且與control組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖1)。

與control組相比，*P<0.05圖1 0.25 μmol/L毒胡蘿卜素與0.2 mmol/L尿酸對HBZY-1細胞GRP78、PDI蛋白表達的影響Figure 1 Effect of 0.25 μmol/L thapsigargin and 0.2 mmol/L UA on expression of GRP78 and PDI proteins in HBZY-1

RT-PCR結(jié)果顯示，除0.05 mmol/L及0.1 mmol/L組外，0.2 mmol/L及0.4 mmol/L組GRP78及PDI mRNA的表達與0 mmol/L比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖2)。

與0 mmol/L相比，*P<0.05圖2 不同濃度尿酸對HBZY-1細胞GRP78,PDI mRNA表達的影響Figure 2 Effect of uric acid on mRNA of GRP78 and PDI in HBZY-1 by RT-PCR

RT-PCR結(jié)果顯示，0.2 mmol/L尿酸作用于HBZY-1細胞24，36，48 h，各時間組GRP78及PDI mRNA的表達與0 h比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖3)。

Western印跡結(jié)果顯示，0.2 mmol/L尿酸作用于HBZY-1細胞24，36，48 h，各時間點GRP78及PDI蛋白的表達與0 h比較均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖4)。

與0 h相比，*P<0.05圖3 0.2 mmol/L尿酸作用不同時間對HBZY-1細胞GRP78及PDI mRNA表達的影響Figure 3 Effect of 0.2 mmol/L uric acid for different time on mRNA of GRP78 and PDI in HBZY-1

與0 h相比，*P<0.05圖4 0.2 mmol/L尿酸作用不同時間對HBZY-1細胞GRP78及PDI蛋白表達的影響Figure 4 Effect of 0.2 mmol/L uric acid for different time on expression of GRP78 and PDI proteins in HBZY-1

2.2 尿酸對大鼠腎小球系膜細胞的形態(tài)學(xué)影響及4-PBA的干預(yù)作用

control組及4-PBA組HBZY-1細胞呈緊密的單層融合的三角形、不規(guī)則型貼壁生長,而UA組HBZY-1細胞體積增大,兩端突起呈長梭形,類似纖維細胞樣形態(tài)(見圖5)，而UA+4-PBA組HBZY-1細胞形態(tài)亦呈緊密的單層融合的三角形、不規(guī)則型貼壁生長。透射電鏡下control組及4-PBA組HBZY-1細胞微毛密長,而0.2 mmol/L UA組細胞表面微毛短縮,融合,數(shù)量減少,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴張，而UA+4-PBA組HBZY-1細胞微絨毛密長，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張(見圖6)。

圖5 4-PBA對HBZY-1細胞形態(tài)的影響 (倒置顯微鏡，×100)Figure 5 Effect of 4-PBA on phenotypic change in HBZY-1 cells (inverted microscope, ×100)

圖6 4-PBA對HBZY-1細胞超微結(jié)構(gòu)的影響 (透射電鏡,×20 000)Figure 6 4-PBA on ultrastructure changes in HBZY-1 (transmission electron microscope, ×20 000)

2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)GRP78、PDI在尿酸誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細胞表型轉(zhuǎn)化中的變化及4-PBA的干預(yù)作用

Western印跡結(jié)果顯示，與control組比較，4-PBA組GRP78及PDI蛋白表達無明顯變化，而UA組GRP78及PDI蛋白的表達均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與UA組比較，UA+4-PBA組GRP78及PDI蛋白的表達均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖7)。

與control組相比，*P<0.05；與UA組相比，#P<0.05圖7 4-PBA對HBZY-1細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78及PDI表達的影響Figure 7 Effects of 4-PBA on the expression of GRP78 and PDI proteins in HBZY-1

2.4 α-SMA、TGF-β1、Fn在尿酸誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細胞表型轉(zhuǎn)化中的變化及4-PBA的干預(yù)作用

Western blot印跡結(jié)果顯示，與control組比較，4-PBA組α-SMA、TGF-β1、Fn蛋白表達無明顯變化，而UA組GRP78及PDI蛋白的表達均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與UA組比較，UA+4-PBA組α-SMA、TGF-β1、Fn蛋白的表達均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖8)。

3 討論

腎小球硬化是多種慢性腎臟疾病終末期的最后歸途，最終導(dǎo)致腎功能衰竭，對機體造成極大危害。大量研究表明，各種腎臟固有細胞包括系膜細胞、足細胞、近端腎小管上皮細胞在腎臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中均可發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，并由病變初期的受損靶細胞轉(zhuǎn)化而主動參與病變進程[5]。其中，腎小球系膜細胞表型轉(zhuǎn)化在腎小球病變從早期的炎癥反應(yīng)向晚期的硬化發(fā)展過程中起重要作用。腎小球系膜細胞是腎臟的主要固有細胞之一，正常情況下，腎小球系膜細胞僅履行吞噬、維持細胞外基質(zhì)正常代謝，通過收縮調(diào)節(jié)腎小球濾過率等功能[6]。但由于系膜細胞和毛細血管袢之間不存在基底膜，系膜細胞直接與毛細血管袢相鄰接，任何來自血流異常信號如高血糖[7]、高血脂[8]、缺血損傷、血流動力學(xué)改變、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)堆積、系膜區(qū)免疫復(fù)合物沉積等多種病理因素損害情況下均可直接刺激系膜細胞，使之增殖、肥大，分泌大量細胞外基質(zhì)并出現(xiàn)形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能的改變，由靜止/成熟表型轉(zhuǎn)化為增殖/分泌表型，即轉(zhuǎn)分化具有肌成纖維細胞樣特性，重新表達α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)，導(dǎo)致各種細胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、血小板衍化生長因子(PDGF)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)n)、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原等釋放，促進腎小球硬化[9]。

與control組相比，*P<0.05；與UA組相比，#P<0.05圖8 UA對HBZY-1細胞表型轉(zhuǎn)化蛋白α-SMA、TGF-β1及Fn表達的影響及4-PBA的干預(yù)作用Figure 8 Effects of UA and 4-PBA on the protein of α-SMA, TGF-β1 and Fn in HBZY-1

我們課題組前期研究[3]發(fā)現(xiàn)0.1 mmol/L以上的尿酸可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞形態(tài)從三角形、不規(guī)則形轉(zhuǎn)化為長梭形類似纖維細胞樣形態(tài)，且表型轉(zhuǎn)化特異性指標(biāo)α-SMA mRNA及蛋白水平表達增強，致纖維化因子TGF-β1的mRNA和蛋白表達亦明顯上調(diào)，同時細胞外基質(zhì)成分fibronectin的mRNA和蛋白表達也同時上調(diào)，均提示尿酸可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的系膜細胞從靜止/成熟型轉(zhuǎn)化為增殖/分泌型，與腎小球硬化硬化有關(guān)[10]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)膽固醇、類固醇等其他脂質(zhì)生物合成的重要部位，同時也能合成多種分泌蛋白及結(jié)構(gòu)蛋白，并且為蛋白質(zhì)的正確折疊提供穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，同時也是鈣離子的儲存場所。正常情況下，內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)揮正常功能的基本條件。其主要由未折疊蛋白反應(yīng)這一適應(yīng)性的程序調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)涉及到多種病理損傷機制，如脂質(zhì)過度負荷、缺血、神經(jīng)變性及功能紊亂、感染、藥物、毒素等均可擾亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致大量錯誤或未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集，通過激活下游包括PERK、ATF6、IRE1等信號通路，引起一系列的細胞反應(yīng)[11]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其誘導(dǎo)的細胞凋亡參與了許多疾病的病理生理過程。近年來，國內(nèi)外多項研究[12]表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)與腎臟疾病密切相關(guān)。

在本實驗中，與對照組比較，在一定時間及濃度范圍內(nèi)，尿酸可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78及PDImRNA及蛋白高表達，證實尿酸可誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。

尿酸可誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細胞從單層融合的三角形、不規(guī)則形態(tài)轉(zhuǎn)化為兩端突起呈長梭形,類似纖維細胞樣形態(tài)，超微結(jié)構(gòu)可見尿素組系膜細胞微絨毛短小，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴張。尿酸也可誘導(dǎo)系膜細胞表型轉(zhuǎn)化特異性指標(biāo)α-SMA、TGF-β1、FN mRNA及蛋白的表達，為了驗證高尿酸誘導(dǎo)腎小球系膜細胞表型轉(zhuǎn)化與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)性，本研究應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)抑制劑進行干預(yù)。4-苯基丁酸(4-PBA)是一種具有分子伴侶作用的短鏈芳香族脂肪酸,它可以逆轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)分子的錯誤移位和錯誤聚集并幫助其建立正常的空間結(jié)構(gòu),從而具有抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和誘導(dǎo)分化的作用[13]。本研究中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用4-PBA干預(yù)大鼠腎小球系膜細胞，不僅可明顯減輕尿酸誘導(dǎo)的GRP78和PDI的表達，即減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而且顯著抑制大鼠腎小球系膜細胞表型轉(zhuǎn)化特異性指標(biāo)α-SMA、TGF-β1、FN mRNA及蛋白的表達，提示高尿酸條件下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)參與體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞表型轉(zhuǎn)化。

綜上，本研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)參與尿酸誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細胞表型轉(zhuǎn)化，其抑制劑4-PBA可抑制該過程，同時為高尿酸腎病發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)。但尿酸性腎病發(fā)病機制十分復(fù)雜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)下游信號通路是否參與其中，還需進一步探索及補充。