覃顏

(珠海市斗門區(qū)婦幼保健院醫(yī)院，廣東 珠海 519125)

0 引言

染色體非整倍體異常屬于胎兒常見的一種染色體異常，每三百個胎兒中就有一個胎兒發(fā)病，主要包括13-三體綜合征、18-三體綜合征、21-三體綜合征等[1]。其中21-三體綜合征也叫做唐氏綜合征，患兒表現(xiàn)以先天智力低下、五官畸形、四肢畸形等癥狀為主[2]。因此產(chǎn)前檢查中準(zhǔn)確診斷胎兒染色體非整倍體疾病，對優(yōu)生優(yōu)育具有重要意義。上世紀(jì)以來，我國在孕中期逐漸開展血清學(xué)篩查，隨著研究的深入，更多的無創(chuàng)性篩查指標(biāo)得到應(yīng)用[3]。無創(chuàng)DNA 產(chǎn)前檢測通過測量孕婦外周血，提取總游離DNA，然后使用高通量測序技術(shù)結(jié)合生物學(xué)信息分析，獲得胎兒的游離DNA 片段，以此判斷胎兒的染色體異常情況[4]。無創(chuàng)DNA 產(chǎn)前檢測不對孕婦造成創(chuàng)傷，具有較高的敏感度和特異度，眾多研究證實該方法對21-三體綜合征的檢出率在99%左右[5]。為此，本文將對在胎兒染色體非整倍體疾病診斷中采用無創(chuàng)DNA 產(chǎn)前檢測的價值展開探討，詳細(xì)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本次研究共2685 例研究對象，均選自在我院進(jìn)行圍產(chǎn)期保健的單胎孕婦，選取時間范圍在2019 年01 月至2020 年06 月期間。其中219 例為唐氏篩查高風(fēng)險，431 例為臨界風(fēng)險，2035例為沒有高危因素直接進(jìn)行早期唐篩和無創(chuàng)DNA 檢測。其中年齡最小19 歲，最大46 歲，平均年齡為(30.26±4.39)歲；孕周最小12 周，最大26 周，平均孕周(18.46±1.41)周。。全部孕婦及家屬了解研究內(nèi)容，同意參與研究并簽字。

1.2 方法

標(biāo)本采集和處理：采集所有孕婦外周血7mL，放置于EDTA抗凝管中，8 個小時之內(nèi)進(jìn)行離心處理，離心環(huán)境4℃，離心速度3000r/min 和13000r/min 各進(jìn)行離心處理10 分鐘，做好血漿分離工作，分裝(每管650μL)放置于80℃的環(huán)境中進(jìn)行保存。采取DNA 提取試劑盒(來源于德國，QIAGEN)應(yīng)用磁珠分離對樣品DNA 進(jìn)行抽提；應(yīng)用克列諾酶、T4 多聚核苷酸激酶和T4 DNA 聚合酶對所提取到的血漿DNA 末端進(jìn)行補(bǔ)平，在血漿DNA 的3"末端±基“A”，將特定接頭接在DNA 片段末端，應(yīng)用PCR 技術(shù)對含有接頭的兩端DNA 片段展開擴(kuò)增處理，獲取到與樣本相對應(yīng)的DNA 文庫，對所獲取到的DNA 文庫展開質(zhì)量檢測，檢測符合要求展開上機(jī)測序。無創(chuàng)DNA 檢測：采取高通量基因測序展開產(chǎn)前篩查檢測，測序儀器選取為Illumina Nextseq500 二代測序儀，確保所獲得的有效reads 數(shù)大于等于400M，平均每個樣本reads 數(shù)大于等于4M。參考BWA map軟件將人類基因組參考序列圖譜和運(yùn)行序列展開對比。采取NIPT 分析系統(tǒng)(來源于廣州萬德基因醫(yī)學(xué)科技有限公司)以分析結(jié)果為依據(jù)統(tǒng)計每一條染色體含有的序列個數(shù)。分析胎兒的患病風(fēng)險以及染色體核型。

對于無創(chuàng)DNA 檢測結(jié)果陽性者，進(jìn)一步實施羊水穿刺或者胎兒染色體核型分析證實結(jié)果。在妊娠18 周至24 周期間通過超聲引導(dǎo)下進(jìn)行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取20mL 羊水，送至實驗室培養(yǎng)，得到細(xì)胞，通過滴片處理后G 顯帶分析，每例觀察20 個分裂象。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 所有孕婦無創(chuàng)DNA 檢測結(jié)果情況

全部2685 例孕婦中，無創(chuàng)DNA 產(chǎn)前檢測結(jié)果顯示，74 例陽性孕婦，陽性檢出率2.76%，74 例陽性孕婦中6 例為21-三體陽性，2 例為18-三體陽性，3 例為13-三體陽性，63 例性染色體及其他染色體異常，詳情如表1 所示。

表1 無創(chuàng)DNA 檢測結(jié)果情況[n(%)]

2.2 無創(chuàng)DNA 和羊水染色體核型結(jié)果對比

對74 例陽性孕婦進(jìn)一步行羊水穿刺檢查，結(jié)果9 例得到確診，6 例為21-三體陽性，1 例為18-三體陽性，0 例為13-三體陽性，2 例性染色體及其他染色體異常；無創(chuàng)DNA 檢測結(jié)果和羊水染色體核型結(jié)果之間具有良好的一致性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，詳情如表2 所示。

表2 無創(chuàng)DNA 和羊水染色體核型結(jié)果對比[n(%)]

3 討論

胎兒染色體非整倍體疾病給患兒的家庭以及社會均帶來巨大的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響到了我國新出生人口的素質(zhì)[6]。因此如何有效控制和減少出生缺陷，一直是臨床婦科重點關(guān)注的問題。目前臨床針對胎兒染色體非整倍體疾病診斷以血清學(xué)生化篩查為主，其中在孕中期進(jìn)行血清學(xué)三聯(lián)篩查法對該類型疾病的檢出率最高可達(dá)75%[7]。而酶聯(lián)免疫法作為主要的檢測方法應(yīng)用比較廣泛，但是該檢驗方法容易受到多種因素的影響，造成各個單位診斷指標(biāo)有所區(qū)別，進(jìn)而造成診斷特異性和敏感性受到干擾，假陽性率較高[8]。而羊膜腔穿刺、臍血穿刺雖然是目前胎兒染色體非整倍體疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，但是該方法屬于侵入性操作，并且由于孕婦數(shù)量的不斷增多，現(xiàn)階段的衛(wèi)生資源無法滿足產(chǎn)前診斷需求[9]。

隨著臨床高通量測序技術(shù)的不斷進(jìn)步，無創(chuàng)DNA 產(chǎn)前檢測逐漸應(yīng)用于胎兒染色體非整倍體疾病的診斷中。從本次研究結(jié)果看出，無創(chuàng)DNA 產(chǎn)前檢測共檢出74 例陽性孕婦，而羊水穿刺檢查共證實9 例孕婦，可見無創(chuàng)DNA 檢測結(jié)果和羊水染色體核型結(jié)果之間具有良好的一致性(P＜0.05)。對于拒絕有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷或者存在侵入性產(chǎn)前診斷禁忌癥的孕婦，無創(chuàng)DNA檢測具有快捷、無創(chuàng)等優(yōu)勢，安全性較高，不會受到母體孕周或者生育年齡等因素的影響，避免了對孕婦和胎兒造成損傷[10]。無創(chuàng)DNA 檢測有效提高了產(chǎn)前診斷的準(zhǔn)確性，減少了傳統(tǒng)檢測方法給孕婦帶來的精神負(fù)擔(dān)，避免了羊水穿刺等侵入性操作造成的并發(fā)癥風(fēng)險，不會增加流產(chǎn)的發(fā)生幾率，為產(chǎn)前診斷提供了新方法，可作為傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷技術(shù)有效的輔助手段。本次研究中無創(chuàng)DNA 檢測存在一定假陽性情況，可見無創(chuàng)DNA 檢測仍然一定的局限性。無創(chuàng)DNA 檢測只能對胎兒染色體拷貝數(shù)異常情況進(jìn)行檢出，而對于易位型、嵌合體、微缺失等結(jié)構(gòu)異常無法有效檢出，所以在產(chǎn)前診斷中可將無創(chuàng)DNA 檢測技術(shù)和其他產(chǎn)前篩查體系相結(jié)合。

綜上所述，無創(chuàng)DNA 產(chǎn)前檢測應(yīng)用于胎兒染色體非整倍體疾病診斷中，具有較高的準(zhǔn)確率，同時操作便捷、安全性較好具有良好的臨床推廣意義。