吳小楊，黃艮彬，謝雯熙

偏頭痛是神經內科常見疾病之一，主要臨床表現(xiàn)為一側或雙側搏動性劇烈頭痛，呈反復發(fā)作，發(fā)作時還伴惡心、嘔吐、畏光及畏聲等，給病人及其家庭帶來不同程度負擔，生活質量嚴重下降[1]。在我國偏頭痛患病率一般為9.3%[2]，而有關福建畬族人群流行病學調查顯示其偏頭痛患病率高達10.5%，考慮與其獨特生活方式、文化傳統(tǒng)及遺傳背景有關[3]。迄今為止，偏頭痛發(fā)病機制仍不十分明確，大量研究均提示偏頭痛有明顯遺傳傾向及家族易感性，基因突變是其重要體現(xiàn)方式之一[4]。Anttila等[5]進行了1項納入29種大規(guī)模全基因組關聯(lián)研究的Meta分析，新發(fā)現(xiàn)了與偏頭痛相關的5個基因多態(tài)位點rs4379368、rs10504861、rs10915437、rs12134493和rs13208321。本研究前期已確認rs4379368變異是福建畬族人群偏頭痛的遺傳風險標志物[6]，但對于其對畬族偏頭痛病人的影響及診斷價值尚不明確。本研究選取300例畬族偏頭痛病人和300名畬族正常人群作為研究對象，探討rs4379368基因突變對畬族偏頭痛病人的影響，并分析其診斷價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取300例畬族偏頭痛病人作為病例組，入組標準：①符合國際頭痛協(xié)會頭痛分類委員會2004年制定的偏頭痛國際標準[7]，且由兩位副高級以上醫(yī)師確診；②病人及其父母親均為畬族人；③年齡≥15歲，能清晰描述自己癥狀。排除標準：①合并顱內感染、腦出血、腦梗死、蛛網膜下腔出血及腦腫瘤等神經系統(tǒng)疾??；②其他疾病導致的頭痛；③妊娠或哺乳期女性。同期選取年齡及性別與病例組匹配的300名畬族正常人群作為對照組，確認無慢性頭痛病史及家族史。本研究所有研究對象均簽署知情同意書，且已獲得本院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 標本收集 抽取所有研究對象3 mL外周血于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管和分離膠促凝管中，前者充分混勻后直接保存用于rs4379368基因突變檢測；后者經3 000 r/min離心10 min，收集上清并保存用于腦源性神經營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase receptor B，TrkB)、磷酸化細胞外調節(jié)蛋白激酶(phosphorylated extracellular regulated protein kinases，p-ERK)和磷酸化環(huán)磷酸腺苷(cAMP)反應結合蛋白(phosphorylated cAMP-response element binding protein，p-CREB)檢測。標本保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 血清rs4379368基因突變檢測 采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction linked restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)檢測rs4379368基因突變。第一，全基因組DNA提?。喝】鼓鈨龊蠹尤氲鞍酌窴，充分混勻，后參考說明書完成全血基因組DNA提??；第二，聚合酶鏈式反應(PCR)擴增。①設計并合成引物，正向引物：5′-AGTGGGCTTTCATTCTGGAA-3′；反向引物：5′-AAGGGCCTGAAATCTAATTCC-3′；②反應體系20 μL，具體包括1 μL DNA模板、各0.5 μL正反向引物、12.5 μL混合物、5.5 μL 雙蒸水(ddH2O)；③擴增條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)，最后在72 ℃下再延伸5 min；第三，PCR-RFLP：反應體系20 μL，包括17 μL上述PCR擴增產物，2 μL 10×Buffer和1 μL HphI限制性核酸內切酶，于37 ℃溫浴1 h進行酶切，后將產物置于2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，并于凝膠成像儀上記錄酶切結果。根據酶切圖譜判斷個人基因型。

1.2.3 血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB蛋白水平檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB蛋白水平；取出標本解凍，參考各試劑盒操作說明書進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數據處理。定量資料用均數±標準差(x±s)表示，采用t檢驗；定性資料用構成比(%)表示，采用χ2檢驗；用擬合優(yōu)度χ2檢驗分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡檢驗；采用Spearman相關分析探討基因型與血清BDNF、TrkB、p-ERK 和p-CREB蛋白的關系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 rs4379368位點PCR-RFLP結果分析 rs4379368位點PCR擴增片段長度為258 bp，經HphI內切酶酶切瓊脂糖凝膠電泳分離后有2個等位基因C和T，3種基因型：CC型、CT型和TT型。詳見圖1。

圖1 rs4379368位點HphI內切酶酶切電泳圖

2.2 兩組等位基因和基因型分析 應用擬合優(yōu)度χ2檢驗分析病例組和對照組基因型分布發(fā)現(xiàn)，病例組(χ2=0.091，P>0.05)和對照組(χ2=0.143，P>0.05)符合Hardy-Weinberg平衡規(guī)則；但兩組等位基因和基因型頻數分布比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組等位基因和基因型分析 單位：例

2.3 兩組血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB蛋白水平比較 與對照組比較，病例組血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB蛋白水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 兩組血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB蛋白水平比較 (x±s)

2.4 rs4379368位點基因型與血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB蛋白的關系 Spearman相關分析結果顯示，基因型TT與血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB呈正相關(P<0.05)，基因型CC與血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB呈負相關(P<0.05)，基因型CT與血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB無相關性(P>0.05)。詳見表3。

表3 rs4379368位點基因型與血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB蛋白的關系

3 討 論

偏頭痛是一種臨床常見的慢性神經血管性疾病，可發(fā)生于任何年齡，其患病率明顯上升，尤以年輕女性多見[8-9]。近年來，分子遺傳學發(fā)展迅速，成為偏頭痛發(fā)病機制的重要熱點之一[10]。本研究前期已確認福建畬族偏頭痛病人存在rs4379368位點基因突變，但未進行大數據驗證。本研究收集福建300例畬族偏頭痛病人和300名畬族正常人群作為研究對象，發(fā)現(xiàn)兩者等位基因和基因型頻數分布比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中畬族偏頭痛病人等位基因T和基因型TT頻數分布明顯高于畬族正常人群，提示T等位基因有增加畬族人群患偏頭痛的風險，畬族正常人群罹患偏頭痛可能是等位基因C突變?yōu)榈任换騎所致，為畬族偏頭痛病人診療提供了一個新的突破點，是本研究重要創(chuàng)新點之一。

偏頭痛發(fā)病機制仍不明確，其中三叉神經血管學說被認為是所有學說的“頭領”，其將神經、血管及遞質三者完美結合，形象地解釋了偏頭痛的發(fā)病過程[11]。神經營養(yǎng)因子是神經元生長和存活所必需物質，而BDNF是神經營養(yǎng)因子家族重要成員之一[12]。大部分研究均提示，BDNF是中樞神經系統(tǒng)疼痛產生途徑中重要的神經傳導因子，在多種不同形式痛覺中樞敏化過程中占有重要地位[13]。Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，頭端前扣帶回皮質(rostral anterior cingulate cortex，rACC)是調節(jié)慢性疼痛負性情感的關鍵結構，與BDNF/TrkB信號通路密切相關，而細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK)則是rACC中BDNF/TrkB介導信號通路的重要下游效應器，有助于神經性疼痛相關的惡性發(fā)展。此外，還有學者發(fā)現(xiàn)BDNF和TrkB結合后可激活ERK信號通路，使ERK磷酸化，以進一步活化cAMP反應結合蛋白(CREB)，最終使BDNF水平升高，形成循環(huán)，參與神經疼痛調節(jié)[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，畬族偏頭痛病人血清BDNF、TrkB、p-ERK 和p-CREB蛋白水平明顯高于畬族正常人群，提示BDNF/TrkB相關信號通路在畬族偏頭痛發(fā)生過程中占有一定地位。Spearman相關分析結果顯示，基因型TT與血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB呈正相關，基因型CC則與血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB呈負相關，基因型CT與血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB無相關性，提示基因型TT可激活BDNF/TrkB相關信號通路，參與偏頭痛發(fā)生，而基因型CC則可在一定程度上抑制BDNF/TrkB相關信號通路，阻止其向偏頭痛發(fā)展。

綜上所述，rs4379368位點等位基因及基因型在畬族偏頭痛病人和畬族正常人群中差異明顯，有一定鑒別診斷價值，其中基因型CC和基因型TT與血清BDNF、TrkB、p-ERK和p-CREB水平密切相關。