溫曉敏，焦 蓉，張愛明，葉明陽，王文翔

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是新生兒因圍生期窒息引起中樞神經(jīng)缺氧缺血性顱腦損傷[1]。HIE是嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的主要原因，屬于新生兒常見疾病，致死率較高，預后較差，臨床上缺少有效病情診斷的分子標志物[2]。新生兒行為神經(jīng)測定(neonatal behavioral neurological assessment，NBNA)評分是早期評估新生兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能受損和預后的敏感指標。相較于頭顱CT、Sarnat分度等方法，NBNA評分具有更高的特異性、敏感度，且更為簡便、全面[3]。低氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1 alpha，HIF-1α)與HIE發(fā)生有關，其作用是在氧分壓較低的環(huán)境下維持細胞穩(wěn)態(tài)[4]。微小RNA-210(microRNA-210，miR-210)是miRNA一員，參與生物體細胞增殖、分化、凋亡等[5]。研究表明，miR-210與新生兒HIE密切相關[6]。NBNA評分及HIF-1α、miR-210均能在一定程度上反映HIE病情發(fā)展，因此，若將NBNA評分與HIF-1α、miR-210測定聯(lián)合，對疾病診斷可能更加全面。但目前探討三者在新生兒HIE病情發(fā)展中的相關性，從而將HIF-1α、miR-210及NBNA評分聯(lián)合應用于新生兒HIE早期診斷的研究較少。因此，本研究通過檢測HIE新生兒血清中HIF-1α、miR-210水平，同時測定NBNA評分，探討二者與NBNA評分之間的相關性，從而為臨床上開發(fā)新生兒HIE病情的診斷指標提供新思路，對評價其早期危險性具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年3月—2019年2月本院收治的80例HIE新生兒為研究對象(HIE組)，同期選取75名正常新生兒作為對照組。納入標準：①符合中華醫(yī)學會兒科分會新生兒組學對新生兒HIE的診斷標準[7]；②臨床資料齊全者；③出生24 h內(nèi)入院者；④母孕期體健，無煙酒等不良嗜好者。排除標準：①伴有心肺疾病者；②伴有其他并發(fā)癥及感染性疾病者；③先天性畸形者；④先天性遺傳代謝性疾病者。本試驗經(jīng)醫(yī)院臨床研究倫理委員會批準，符合倫理學標準，所有研究對象均由專業(yè)人員詳細告知家長研究內(nèi)容并同意參加，并簽署知情同意書。收集兩組一般資料，包括胎齡、性別、出生體重等，記錄Apgar評分，包括肌張力、脈搏、皺眉動作即對刺激的反應、外貌、呼吸，理論最高值10分。

1.2 主要試劑與儀器 缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)分析檢測試劑盒(貨號：FK-KJ0389)，購自上海樊克生物科技有限公司；RNA提取試劑盒(貨號：dp419)，購自北京天根生化有限公司；AceQ qPCR SYBR?Green Mix(貨號：Q111-02)，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；miScript SYBR?Green qPCR Kit(貨號：218076)，購自德國QIAGEN公司。ABI7700實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)儀，購自美國Applied Biosystems公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集及保存 抽取兩組新生兒清晨空腹靜脈血，3 000 r/min離心15 min后收集血清，置于-80 ℃保存待測。

1.3.2 檢測血清相關指標 檢測血清相關指標，包括血清總鈣(calcium，Ca)、血清天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate amino transferase，AST)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)水平。

1.3.3 檢測血清中HIF-1α水平 ELISA法檢測兩組新生兒血清HIF-1α水平，檢測方法嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.4 檢測血清miR-210水平 采用qRT-PCR法檢測兩組新生兒血清miR-210水平。采用RNA提取試劑盒提取血清總RNA，反轉錄得cDNA。采用qRT-PCR儀對miR-210進行擴增。qRT-PCR反應體系共10 μL：cDNA(50 ng/μL)1 μL，miScript SYBR?Green Mix 5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O 3.0 μL，引物由上海生工生物公司合成。反應條件：95 ℃、10 min；95 ℃、30 s，58 ℃、1 min，40個循環(huán)；72 ℃，10 min。miR-210及內(nèi)參U6引物序列見表1。采用2-△△CT法對血清miR-210表達水平進行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.5 新生兒NBNA評分檢測 新生兒出生后均于第7天進行NBNA評分，檢測項目主要包括：主動肌張力、被動肌張力、新生兒行為能力、原始反射、一般反應。滿分40分，NBNA評分>36分者正常，35～36分者臨界異常，<35分者異常。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。定量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示，采用t檢驗；定性資料采用χ2檢驗；采用Pearson法分析HIE新生兒血清HIF-1α、miR-210水平與NBNA評分的相關性；Logistic回歸分析新生兒HIE的影響因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 兩組一般資料比較 兩組胎齡、性別、出生體重比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。HIE組Apgar評分明顯低于對照組(P<0.05)。詳見表2。

表2 兩組臨床資料比較

2.2 兩組血清HIF-1α、miR-210水平及NBNA評分比較 HIE組血清HIF-1α、miR-210水平明顯高于對照組(P<0.05)，NBNA評分明顯低于對照組(P<0.05)。詳見表3。

表3 兩組血清HIF-1α、miR-210水平及NBNA評分比較 (x±s)

2.3 兩組血清相關指標比較 兩組血清Ca比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。HIE組血清AST、LDH、CK、CK-MB水平明顯高于對照組(P<0.05)。詳見表4。

表4 兩組血清相關指標比較 (x±s)

2.4 HIE新生兒血清HIF-1α、miR-210水平與NBNA評分的相關性 Pearson法分析結果顯示，HIE新生兒血清HIF-1α、miR-210水平與NBNA評分均呈負相關(r值分別為-0.559、-0.567，P均<0.05)。詳見圖1、圖2。

圖1 HIE新生兒血清HIF-1α水平與NBNA評分的相關性

圖2 HIE新生兒血清miR-210水平與NBNA評分的相關性

2.5 HIE新生兒HIF-1α、miR-210及NBNA評分與血清相關指標的相關性 Pearson法分析結果顯示，HIE新生兒血清AST、LDH、CK、CK-MB與HIF-1α、miR-210呈正相關(P<0.05)，與NBNA評分呈負相關(P<0.05)。詳見表5。

表5 HIE新生兒HIF-1α、miR-210及NBNA評分與血清相關指標的相關性

2.6 影響新生兒HIE的多因素分析 將新生兒是否發(fā)生HIE作為因變量，以HIF-1α、miR-210、NBNA評分、Apgar評分、AST、LDH、CK、CK-MB為自變量進行Logistic回歸分析，結果顯示，HIF-1α、CK-MB是影響新生兒HIE的危險因素，NBNA評分是影響新生兒HIE的保護因素。詳見表6。

表6 影響新生兒HIE的多因素分析

3 討 論

新生兒HIE發(fā)病機制較為復雜，新生兒發(fā)生HIE后腦能量代謝衰竭，大量中性粒細胞及氧自由基相互作用導致新生兒腦功能出現(xiàn)損傷，是臨床上圍生期新生兒致殘甚至死亡的主要原因之一[8]。新生兒HIE會引發(fā)多種神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，使得社會整體人口素質(zhì)降低，家庭生活質(zhì)量也嚴重下降[9]。因此，尋找早期評估和診斷腦損傷的指標，對臨床上新生兒HIE治療和預后有重要意義。

HIF-1α受缺氧信號調(diào)控，其C末端是活性調(diào)控區(qū)域，能感受缺氧信號[10]。當機體缺氧時，HIF-1α聚集并與HIF-1β結合形成復合物，進而激活下游相關靶基因，調(diào)節(jié)一系列生長介質(zhì)和細胞因子變化從而對疾病造成影響。HIE發(fā)生時，HIF-1α通過激活凋亡相關基因，使腦組織適應缺氧環(huán)境，從而發(fā)揮重要作用[11]。miR-210參與缺氧缺血環(huán)境下臟器組織出現(xiàn)的血管新生，與供血和保護神經(jīng)元作用關系密切。miR-210能調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，腦缺血損傷后miR-210參與組織損傷后的神經(jīng)發(fā)生過程。且miR-210能破壞HIE血腦屏障完整性，誘導HIE新生兒出現(xiàn)腦水腫[12]。NBNA評分是一項簡單實用的用于新生兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損及HIE預后評定的方法[13]，是北京協(xié)和醫(yī)院兒科主任鮑秀蘭教授以美國和法國新生兒行為神經(jīng)測定法為基礎，結合臨床經(jīng)驗而創(chuàng)定的評分方法，20個項目共40分，具有較好的特異性和靈敏度。郭穎等[13]通過檢測HIE患兒血清HIF-1α水平并對其進行NBNA評分，證明HIE患兒血清HIF-1α水平隨病情加重而升高，且與NBNA評分呈負相關。本研究結果顯示，HIE組血清HIF-1α、miR-210水平明顯高于對照組，NBNA評分明顯低于對照組；HIE新生兒血清HIF-1α、miR-210水平與NBNA評分均呈負相關。提示HIE患兒血清HIF-1α、miR-210水平與病情的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系。分析血清中HIF-1α、miR-210可能通過某種聯(lián)系影響新生兒神經(jīng)系統(tǒng)損傷，進而影響NBNA評分，進一步提示三者都可作為評估新生兒HIE的參考指標。

研究顯示，Apgar評分是表征新生兒窒息程度的一項指標，可作為新生兒未來腦部受損、發(fā)展及預后的參考指標[14]。且有研究發(fā)現(xiàn)，HIE新生兒血清酶AST、LDH等水平與病情程度成正比[15]。本研究中兩組胎齡、性別、出生體重比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。HIE組Apgar評分明顯低于對照組。提示HIE患兒Apgar評分較低，其窒息程度相對較嚴重。進一步研究發(fā)現(xiàn)，HIE組血清AST、LDH、CK、CK-MB水平均明顯高于對照組。HIE新生兒血清AST、LDH、CK、CK-MB與HIF-1α、miR-210呈正相關，與NBNA評分呈負相關。提示HIE患兒血清酶AST、LDH等水平較正常新生兒高表達，且與HIE病情程度呈正相關。Logistic回歸分析結果顯示，HIF-1α、CK-MB是影響新生兒HIE的危險因素，NBNA評分是新生兒HIE的保護因素。提示臨床上可密切監(jiān)測新生兒HIF-1α、CK-MB、NBNA評分，以便及時采取治療措施，降低發(fā)病概率。

綜上所述，HIE新生兒血清HIF-1α、miR-210水平與NBNA評分均呈負相關，三者與新生兒HIE病情發(fā)展密切相關。將NBNA評分與HIF-1α、miR-210測定聯(lián)合，能更加全面地評價新生兒HIE的早期危險性及預測預后，對新指標的開發(fā)、應用具有重要的臨床意義。但HIF-1α、miR-210水平影響新生兒HIE病情的具體作用機制尚不十分明確，有待進一步深入研究。