劉曉慧 馬麗霞 張晶

肝細胞癌是世界上最常見惡性腫瘤之一，是全球第二大與癌癥相關的死亡原因[1]。氟西汀是一種選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑，在臨床上廣泛應用于抗抑郁治療[2]。越來越多的證據表明，氟西汀能夠抑制多種腫瘤生長，誘導肝癌細胞的凋亡[3-7]。本實驗探討氟西汀對HepG2細胞增殖及凋亡影響的分子機制，為氟西汀應用于肝細胞癌治療提供依據。

材料與方法

一、主要材料與儀器

人肝癌細胞系HepG2細胞購自美國ATCC公司；氟西汀購自美國Sigma公司；細胞周期檢測試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；RNA提取試劑盒購自美國Gibco公司；TAKARA 反轉錄試劑盒、SYBR Premix ExTaqTM購自大連寶生物工程有限公司；兔抗人Bcl-2單抗、Bax單抗購自美國Cell signaling公司；兔抗人Caspase-3多抗、兔抗人β-actin單抗購自美國abcam公司；辣根過氧化物酶標抗兔二抗購自北京中山金橋有限公司。

二、流式細胞術檢測氟西汀對HepG2細胞周期的影響

應用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將HepG2細胞培養(yǎng)至最佳狀態(tài)，將處于對數生長期的HepG2細胞吹打成單個細胞，細胞計數后取2×105個細胞鋪種于6孔板中，培養(yǎng)體系為2 mL。孵育24 h細胞貼壁生長后，棄去原培養(yǎng)基，換為2 mL無血清DMEM培養(yǎng)基，同時培養(yǎng)基內給予不同濃度氟西汀，未加藥組為對照組，孵育24 h后收集細胞，應用碘化丙啶染色方法制成流式標本，上機檢測細胞周期。

三、熒光定量PCR法檢測Bcl-2、Bax mRNA表達

(一)細胞培養(yǎng)及處理 將處于對數生長的HepG2細胞吹打成單個細胞，細胞計數后取2×105個細胞鋪種于6孔板中，培養(yǎng)體系為2 mL。孵育24 h細胞貼壁生長后，棄去原培養(yǎng)基，換為2 mL無血清DMEM培養(yǎng)基，同時培養(yǎng)基內給予12.5 μmoL氟西汀，未加藥組為對照組，分別孵育6 h、12 h、24 h。

(二)實時熒光定量反轉錄PCR 使用RNA提取試劑盒從培養(yǎng)的細胞中提取總RNA，紫外分光光度法測定總RNA含量，然后采用20 μL的反轉錄體系，反轉錄成cDNA， 最后用EASY Dilution將cDNA液按100、101、102、103梯度稀釋后，各取2 μL稀釋好的cDNA進行Real-time PCR，檢測目的基因的擴增效率和管家基因(GAPDH)的擴增效率一致。PCR引物序列如下：Bcl-2上游(5′-3′)gAgAAATCAAACAg-AggCCg，下游(5′-3′)CTgAgTACCTgAACC-ggCA；Bax上游 (5′-3′)TgACCTCACTgTgACCTTgACT，下游(5′-3′)TgAgCAATTCCAgAggCAgT。

四、蛋白質印跡法檢測Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達水平

根據蛋白提取試劑盒說明書步驟提取蛋白質，BCA法測定蛋白質濃度。配置12%SDS-PAGE分離膠，分離等量的蛋白質，然后將其轉移至PVDF膜上。在10 mL 5%脫脂奶粉中加入10 μL(1∶1 000)一抗(分別為兔抗人Bcl-2單抗，兔抗人Bax單抗，兔抗人caspase-3多抗，兔抗人β-actin單抗)，放搖床上4℃輕搖過夜。過夜后，取出PVDF膜，用1×TBST室溫搖床洗3次，每次30 min。將PVDF膜放入相對應的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體(1∶2 000)，放搖床上，4℃輕搖2 h；用1×TBST室溫搖床洗3次，每次30 min。將ECL發(fā)光試劑A 500 μL與試劑B 500 μL混合后，均勻將PVDF膜浸透，將其包于保鮮膜中，反應5 min。在暗室內取出膠片，放在被保鮮膜覆蓋的PVDF膜上，蓋上X-線片夾板，根據條帶亮度調整曝光時間。取出膠片，常規(guī)顯影、定影。膠片經掃描后，用Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)分析條帶灰度值，比較各組目的蛋白/內參蛋白的表達量。

五、統(tǒng)計學分析

結 果

一、氟西汀對HepG2細胞周期影響

氟西汀以濃度依賴方式使HepG2細胞停滯于G2/M期。對照組G2/M期細胞與5 μmoL實驗組G2/M期細胞相比差異無統(tǒng)計學意義(t=，P>0.05)。10 μmoL組和12.5 μmoL組G2/M期細胞與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。各組HepG2細胞不同細胞周期的細胞比例見表1。

二、HepG2細胞不同時間點Bcl-2、Bax的mRNA表達

熒光定量PCR法檢測12.5 μmoL氟西汀處理HepG2細胞0、6、12和24 h后Bcl-2、Bax的mRNA相對表達量并記錄CT值，計算2-△△CT值。結果顯示隨著氟西汀孵育時間延長，HepG2細胞Bcl-2的mRNA表達逐漸降低，各組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；而隨著氟西汀孵育時間延長，HepG2細胞Bax的mRNA表達各組與對照組相比，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表2。

三、氟西汀處理HepG2細胞不同時間點Bax、Bcl-2及caspase-3的蛋白表達

12.5 μmoL氟西汀處理HepG2細胞0、6、12和24 h后Bcl-2蛋白表達在12 h開始下降，Bax蛋白表達與對照組相比無明顯變化，Bax/Bcl-2在12 h及24 h蛋白表達明顯低于對照組(均P<0.01)，caspase-3蛋白表達在12 h開始增多，12 h及24 h蛋白表達均高于對照組(均P<0.05)，見圖1，表3。

圖1 蛋白質印跡檢測Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達

討 論

研究表明，氟西汀抑制人肝癌細胞系HepG2增殖可能與影響細胞周期進程有關，誘導HepG2細胞凋亡則可能是通過線粒體途徑實現的。

氟西汀以濃度依賴方式使HepG2細胞停滯于G2/M期，G2/M期是DNA合成和有絲分裂的準備期，在細胞周期進程中有至關重要的作用。本研究發(fā)現，G2/M期細胞隨著氟西汀濃度增大而增加，因此氟西汀抑制體外培養(yǎng)的HepG2增殖，可能與氟西汀使HepG2在細胞周期G2/M期積累停滯有關。

細胞凋亡是由多種基因控制的程序性死亡，線粒體在細胞凋亡中發(fā)揮舉足輕重的作用。線粒體凋亡途徑是細胞凋亡信號傳導的重要通路，受Bcl-2家族蛋白成員調節(jié)[8]。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，通過阻止細胞色素C從線粒體釋放到細胞質中或與細胞凋亡激活因子結合來調節(jié)細胞凋亡[9]。Bax是與Bcl-2功能相反的一個基因，能促進細胞凋亡。Bax/Bcl-2比值對決定細胞是否進入凋亡狀態(tài)有重要意義[10]。

在線粒體凋亡通路中，DNA損傷、代謝紊亂、藥物誘導等因素可導致線粒體內外膜通透性增加，釋放線粒體凋亡蛋白，包括細胞色素C、凋亡誘導因子等。細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子結合，形成復合物，可促進caspase-9前體的自身活化，活化的caspase-9激活caspase-3，導致細胞凋亡，caspase-3的活化是線粒體凋亡信號通路的關鍵環(huán)節(jié)[11,12]。本研究結果顯示，隨著氟西汀處理時間延長，bcl-2 mRNA和蛋白表達降低，而Bax mRNA和蛋白表達無明顯變化，Bax/Bcl-2及活化的casepase-3蛋白表達增多，說明氟西汀可通過線粒體途徑誘導HepG2細胞凋亡。

表1 各組HepG2細胞不同細胞周期的細胞比例(%，±s)

表2 氟西汀對HepG2細胞Bcl-2、Bax mRNA表達的影響(±s)

表3 Bax/Bcl-2、Caspase-3蛋白表達水平灰度比值結果(±s)

本實驗明確了氟西汀體外的抗肝細胞癌作用，闡明了氟西汀可能是通過影響細胞周期進程和下調Bcl-2表達、激活caspase-3，抑制肝癌細胞系HepG2增殖并誘導其凋亡。后期可通過體內實驗進一步研究氟西汀的肝癌抑制作用。