常哲瀚，邵 國，3

(1.內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院,內(nèi)蒙古 包頭 014060；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)低氧轉化醫(yī)學重點實驗室；3.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院低氧適應轉化醫(yī)學北京市重點實驗室)

不同因素所造成的機體供氧不足或用氧障礙，都可導致缺氧，長時間的缺氧可導致機體產(chǎn)生嚴重損傷，甚至會導致機體的重要器官功能障礙。在機體的各種器官中，腦作為以有氧代謝為主的器官，對氧氣的缺乏極為敏感，并且對缺氧的耐受性較差[1]。臨床上，產(chǎn)生嚴重的急性缺氧后，可在數(shù)分鐘內(nèi)引起腦內(nèi)神經(jīng)元發(fā)生不可逆性損傷甚至死亡。并且大腦在承受長期慢性的缺氧過程中，會引起腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能紊亂和病理結構改變。因此研究缺氧對神經(jīng)產(chǎn)生的損傷，尋找合適有利的方法，提出腦對缺氧耐受性的有效措施，用來增強機體適應低氧環(huán)境下的能力，以及治療、預防臨床缺氧性疾病都具有重要意義。當機體接收到一個亞致死性的缺氧或缺血刺激后，該刺激可以有效改善組織、器官甚至整個機體由于缺氧或缺血所引起的一系列致死性損傷的耐受性，這種現(xiàn)象被稱為缺氧或缺血預處理(HPC或IPC)，在心和腦中，該理論已經(jīng)得到驗證[2]。低氧預適應(Hypoxia preconditioning，HPC)，對機體進行一個亞致死性的低濃度氧刺激后，反復短暫刺激細胞或組織，使機體對后續(xù)更為嚴重的缺氧而產(chǎn)生耐受性，從而對機體產(chǎn)生保護作用。低氧預適應是體內(nèi)一種內(nèi)源性的保護現(xiàn)象，通過亞致死性的刺激，使機體內(nèi)部降低或增加內(nèi)源性神經(jīng)因子，產(chǎn)生神經(jīng)保護作用[3]。低氧預適應可以對低氧造成的多種損傷進行一定程度的改善。有報道，低氧預適應可以改善氧化應激狀態(tài)，清除因缺氧而增多的氧自由基,而低氧預適應產(chǎn)生的腦保護性因子,有可能作為腦損傷或某些神經(jīng)退行性疾病的潛在治療靶點[4]。

Notch基因最早在1917年黑腹果蠅中發(fā)現(xiàn)，因其功能部分缺失造成果蠅翅膀邊緣殘刻(notch)而命名。Notch基因通過受體與配體之間的相互作用而激活，主要調節(jié)組織、器官的分化和發(fā)育[5-6]。Notch受體需要經(jīng)歷三步切割，最終以有活性的胞內(nèi)結構域NICD釋放到胞質中發(fā)揮作用[7-9]。Notch1在神經(jīng)發(fā)生過程中維持神經(jīng)干細胞數(shù)量平衡，Notch1在表達升高的情況下會導致神經(jīng)干細胞增殖[10]。

DNA甲基化是一種穩(wěn)定的表觀遺傳調控方式,通過改變DNA對轉錄因子的可及性來調節(jié)基因轉錄，而不改變DNA本身的編碼序列[11-12]。DNA甲基化的主要特征是位于鳥嘌呤(即CpG二核苷酸)的胞嘧啶殘基的甲基化，通常發(fā)生在被稱為“CpG島”基因的啟動子中。5-氮-2’脫氧胞苷(5-Aza-cdR)是DNA甲基轉移酶抑制劑，是染色體斷裂誘導劑和誘變劑，可以激活三磷酸核苷并參加DNA和RNA的復制轉錄，它可以導致細胞中DNA、RNA和蛋白質合成抑制[13]。DNA甲基化參與Notch1信號調控，胚胎神經(jīng)發(fā)育過程中的Notch1可活化誘導其效應子Hes5的表達。有研究表明，Gcm依賴性基因Hes5轉錄需要DNA去甲基化參與[14]。在胚胎期腦發(fā)育過程中，Notch1信號轉導和DNA去甲基化共同指導神經(jīng)干細胞先分化為神經(jīng)元，后分化為星形膠質細胞。成年小鼠海馬齒狀回(Dentate gyrus,DG)的研究證明，Notch1及其下游基因Hes1的啟動子區(qū)甲基化水平與Notch1及Hes1在mRNA和蛋白的表達呈負相關[15]。

1 對象與方法

1.1實驗動物 選取6～8周齡的SPF級雄性ICR小鼠(18～22 g)120只，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司，實驗小鼠在自然通風條件下自由攝取水和食物，適應性飼養(yǎng)3 d。

1.2實驗儀器及耗材 超聲破碎儀、低溫高速離心機、金屬浴、酶標儀、電泳槽及轉印槽、恒溫搖床、化學發(fā)光儀、手持型勻漿儀、PCR儀、Real-time PCR儀、激光共聚焦顯微鏡。RIPA裂解液、蛋白酶/磷酸酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒、抗氧化劑/上樣緩沖液、電泳液、甲醇、電轉液、PVDF膜、Notch1一抗、HRP驢抗兔二抗、吐溫20、0.01 M TBS、Trizol裂解液、氯仿、異丙醇、75 %乙醇、反轉錄試劑盒、SYBR Green mix、Notch1引物、β-actin引物、96孔板。

1.35-Aza-cdR側腦室注射 將小鼠用1.2 %的戊巴比妥鈉麻醉，待其反射消失后，將小鼠固定于腦立體定位儀上，酒精消毒后，在頭皮做縱向1 cm切口，參考標準小鼠腦立體定位圖譜，暴露前囟，以十字架為原點，在十字架前后0.5 mm，中縫左右1 mm，顱骨平面向下2.5 mm的位置，使用顱鉆鉆孔，吸取10 μM的5-Aza-cdR工作液，以1 μL/min的速度注射總體積為5 μL的5-Aza-cdR工作液，注射完成后停針5 min，使液體充分浸潤并防止漏液后緩慢退針，縫合頭皮放入鼠籠保溫待其蘇醒。對照組注射等體積0.01 M的PBS緩沖液。

1.4復制小鼠低氧預適應模型及實驗分組 注射完成的小鼠在24 h后進行低氧暴露。將急性低氧組小鼠和低氧預適應組小鼠稱重，放入含有新鮮空氣的150 mL廣口瓶中，用橡皮塞密閉瓶體，使用計時器計時。瓶中小鼠出現(xiàn)喘式呼吸、小便失禁、翻正反射消失時即為低氧耐受極限的標志，此時立即取出小鼠，即完成1次低氧暴露，記錄為急性低氧組小鼠(H組)。小鼠恢復正常呼吸時立即將小鼠放入新的干凈150 mL廣口瓶中并蓋緊膠塞，記錄時間，重復4次循環(huán)，記錄為低氧預適應組小鼠(HPC組)。對照組(C組)小鼠不進行低氧處理。低氧預適應模型復制成功后24 h，將小鼠斷頭處死，在冰上分離海馬，置于1.5 mL EP管中立即放入-80 ℃冰箱凍存。其中，C組、H組、HPC組為注射PBS的對照組、急性低氧組和低氧預適應組，5-C、5-H、5-HPC為側腦室注射5-aza-cdR后的對照組、急性低氧組和低氧預適應組。

1.5小鼠海馬中Notch1 mRNA的qRT-PCR檢測 使用Trizol試劑盒，按照說明書步驟提取各組小鼠海馬總RNA，根據(jù)試劑說明書，使用Thermo反轉錄試劑盒，取3 μg總RNA用于cDNA第一鏈合成，利用下列引物對Notch1及β-actin基因進行qRT-PCR檢測。qRT-PCR在標準條件下進行所有實驗至少重復3次。

Notch1 F:CACCCATGACCACTACCCAGTT

Notch1 R:CCTCGGACCAATCAGAGATGTT

β-actin F:AGGTGAAGGTCGGAGTCA

β-actin R:GGTCATTGATGGCAACAA

1.6小鼠海馬中Notch1蛋白表達變化檢測 RIPA裂解液勻漿處理小鼠海馬組織，加入蛋白酶/磷酸酶抑制劑，12 000 rpm在4 ℃離心15 min，收集上清液用于蛋白印跡。根據(jù)說明書，使用Thermo BCA蛋白定量試劑盒測定每個樣品的蛋白濃度。在8 %SDS-PAGE凝膠上電泳分離蛋白后，將蛋白質電轉到PVDF膜上。將膜在5 %的脫脂牛奶中室溫以35轉/min封閉1.5 h，使用0.1 %的TBST洗膜后，將膜在4 ℃條件下使用抗Notch1一抗(1:1 000稀釋，CST)，抗β-actin一抗(1∶1 000稀釋，Santa)孵育過夜。室溫下用綴合辣根過氧化物酶的驢抗兔和山羊抗小鼠抗體孵育1.5 h，0.1 %TBST洗膜后使用ECL超敏發(fā)光液浸泡PVDF膜，檢測抗體的表達。所有實驗生物學重復至少3次。

1.7免疫熒光雙染 側腦室注射前1 d按照50 mg/kg體重計量向小鼠腹腔注射BrdU，側腦室注射5-Aza-cdR及低氧預適應當日按相同計量繼續(xù)注射BrdU以充分標記海馬區(qū)域新生細胞，造模完成后用1.2 %的戊巴比妥鈉麻醉小鼠，通過心尖分別灌注20 mL濃度0.01 M PBS和4 %多聚甲醛固定，剝離整腦在4 %的多聚甲醛中后固定過夜，更換30 %PB蔗糖脫水組織72 h。以20 μm厚度進行冰凍切片，腦片以2 M的鹽酸進行DNA變性后使用0.1 M的四硼酸鈉復性，10 %山羊血清封閉后4℃孵育Notch1(1∶200,CST)及BrdU(1∶250,Abcam)一抗過夜，使用熒光二抗(Alexa Fluor488/594,Invitrogen)室溫避光孵育2 h，最后使用含DAPI的封片劑封片。

1.8統(tǒng)計分析 使用GraphPad Prism 7統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，組間差異應用t檢驗進行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1低氧預適應和5-Aza-cdR處理上調小鼠海馬中Notch1 mRNA的表達 與不注射5-Aza-cdR各組相比，側腦室注射5-Aza-cdR后小鼠海馬中Notch1 mRNA表達升高(P<0.01)，而各組中低氧預適應組相比空白對照組的Notch1 mRNA表達均升高(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組小鼠海馬Notch1 mRNA表達

2.2低氧預適應和5-Aza-cdR處理上調小鼠海馬中Notch1蛋白的表達 與未注射5-Aza-cdR組相比，5-Aza-cdR組小鼠海馬中Notch1蛋白表達升高(P<0.01)，各組中低氧預適應組與空白對照組相比，Notch1蛋白均升高(P<0.05)，見圖2。

圖2 各級小鼠海馬中Notch1蛋白表達

2.35-Aza-cdR處理引起海馬DG區(qū)BrdU陽性細胞增多 綠色熒光為Notch1，紅色熒光為BrdU陽性細胞，可以發(fā)現(xiàn)Notch1在海馬內(nèi)表達主要位于DG區(qū)內(nèi)。相比不注射5-Aza-cdR，注射5-Aza組的小鼠海馬DG區(qū)可以發(fā)現(xiàn)BrdU陽性細胞增多，說明注射5-Aza-cdR可能引起海馬DG區(qū)神經(jīng)細胞增殖。見圖3。

圖3 各組小鼠海馬中陽性細胞

3 討論

腦對缺血缺氧耐受性極低，尤其海馬區(qū)域更易受到由于缺血缺氧所造成的損傷。研究顯示低氧預適應/遠隔缺血預適應能夠顯著增強海馬神經(jīng)元對低氧損傷的耐受能力，預適應后小鼠海馬中多種基因的mRNA和蛋白質表達改變，并且能夠改善小鼠的學習記憶能力[16-17]。研究顯示適度低氧可以激活Notch1的活性，增加神經(jīng)元數(shù)量并且激活長時程增強效應(Long-term potentiaton, LTP)，此外還可誘導神經(jīng)元分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進認知功能，加強學習記憶能力[18]。在Notch1較低的小鼠中，海馬CA1區(qū)突觸的LTP受損，長時程抑制(long-term depression,LTD)增強，而Notch1的配體Jagged1可增強LTP[19-20]。有實驗證明在缺血性卒中的恢復期可激活Notch1的保護作用并上調Hes1基因的表達，增加卒中后神經(jīng)祖細胞的增殖，并且在缺血性卒中后存活期的45 d內(nèi)使用Notch1配體可增加神經(jīng)發(fā)生并改善缺血性損傷后運動功能的恢復[21]。低氧狀態(tài)同樣可以刺激NSC分化，10 %的低氧狀態(tài)促進小鼠NSC的Notch1和VEGF表達，它們可誘導神經(jīng)元突起形成，促進神經(jīng)元生長及延伸。同時，在4 %低氧狀態(tài)和常氧狀態(tài)分別培養(yǎng)神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)低氧狀態(tài)下Notch1表達升高，神經(jīng)元較常氧狀態(tài)下的神經(jīng)元突起延伸更加明顯且突起長度明顯增加[22]。

我們先前的研究表明，隨著低氧次數(shù)的增加，小鼠低氧耐受時間明顯增加，證明重復低氧可以增強小鼠的低氧耐受能力，提高低氧狀態(tài)下機體的存活時間，并且低氧預適應可以在短期內(nèi)提高小鼠的學習記憶能力。在防治缺血缺氧引起的腦病如急性缺血性卒中,一個可行的防治方法就是提高神經(jīng)細胞對缺氧的耐受力，而低氧預適應便是有效的措施，通過對機體進行重復低氧，改善缺血缺氧性腦病的預后，然而目前關于低氧預適應引起神經(jīng)保護的潛在機制仍不明確[23-24]。我們提取各組小鼠海馬組織的總蛋白和RNA，通過qPCR和WB的方法檢測Notch1表達變化，研究發(fā)現(xiàn)蛋白水平，在不注射5-Aza-cdR的小鼠中，相比空白對照組，低氧預適應處理可以激活Notch1蛋白表達，在注射5-Aza-cdR的各組小鼠中，由于甲基化被抑制，Notch1蛋白表達普遍升高且較為明顯，HPC組Notch1蛋白表達升高具有統(tǒng)計學意義，mRNA水平檢測到相似的結果，HPC及5-Aza-cdR注射均可提高Notch1的表達。這些結果提示Notch1表達升高可能是參與低氧耐受神經(jīng)保護的過程。Notch信號通路已被證實用于調節(jié)神經(jīng)干細胞的自我更新、增殖和分化，但對Notch信號傳導活性如何受到調節(jié)尚不明確。實驗證明Notch1啟動子的甲基化水平與DG中Notch1 mRNA和蛋白質表達呈負相關，并且Notch1表達改變可能受DNA甲基化動力學的調節(jié)。我們的研究發(fā)現(xiàn)5-Aza-cdR可以激活Notch1表達，并使海馬DG區(qū)內(nèi)神經(jīng)細胞增殖，這可能是5-Aza-cdR聯(lián)合低氧預適應提高低氧耐受神經(jīng)保護的合適方法。