陳昌貴， 賀立群， 田立群， 易春峰

(武漢市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科, 湖北 武漢 430022)

持續(xù)性低氧可導(dǎo)致非肌型肺小動脈肌化、血管壁的內(nèi)膜增厚、管腔狹窄甚至閉塞從而使肺動脈壓力增加。長期過高的肺動脈壓力會導(dǎo)致右心功能衰竭而死亡。肺血管重構(gòu)是低氧肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension, HPH)持續(xù)發(fā)展的病理生理基礎(chǔ)，低氧誘導(dǎo)肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs)異常增殖在低氧肺血管中起著至關(guān)重要的作用[1, 2]。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs)是核激素受體家族中的配體激活受體，包含3種亞型：PPARα，PPARγ和PPAR δ(也稱PPAR β/δ)。PPAR的活化能夠調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程，包括能量穩(wěn)態(tài)，細胞增殖和分化，葡萄糖代謝，脂肪酸合成及分解代謝。既往研究發(fā)現(xiàn)，PPAR δ具有改善胰島素抵抗、抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、抗動脈粥樣硬化等作用[3, 4]。GW501516也稱為GW-1516，Cardarine或Endurobol，是葛蘭素史克研制的一種PPARδ特異性激動劑，其可促進脂肪代謝，增加骨骼肌對葡萄糖的利用，提高運動耐力，動物實驗表明其具有減肥作用，國外黑市上有部分人購買GW501516用于減肥增肌，但是其長期口服安全性有待進一步研究[5,6]。在氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL)誘導(dǎo)血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)增殖模型中發(fā)現(xiàn)，GW501516能夠阻滯VSMCs于G0/G1期，抑制其增殖[7]。另有研究表明，GW501516能夠通過抑制蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)活化抑制血管緊張素II誘導(dǎo)的VSMCs肥大[8]，而AKT信號通路能夠促進低氧PASMCs增殖[9]。因此本研究觀察PPARδ激動劑GW501516對低氧條件下PASMCs增殖的影響，并探討其可能機制，為低氧肺血管重構(gòu)的防治尋找新靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

體重170～190 g SPF級別雄性SD大鼠購自北京維通利華動物科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0006。

1.2 試劑

I型膠原酶、GW501516、SC79、DMSO、RNase(RNA酶)、Triton X-100、 溴化乙錠(PI)等購自Sigma公司； CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；BrdU試劑盒購Roche公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素雙抗溶液、胎牛血清、胰酶等購自Hyclone公司；細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物科技有限公司，TRIzol購自Invitrogene公司；PPARδ抗體、T-AKT與P-AKT抗體、T-GSK3β與P-GSK3β抗體、GAPDH抗體購自Sigma公司。

1.3 儀器

細胞培養(yǎng)箱 ( Thermo，3131 )，多功能酶標(biāo)儀( Bio-tek公司，Synergy HT)，熒光定量PCR儀(Roche公司，LightCycler 480)，雙色紅外熒光掃描儀(Odyssey公司， LI-COR)。

1.4 SD大鼠PASMCs原代培養(yǎng)

采用濃度為0.2% I型膠原酶消化分離PASMCs[10]，使用含20%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)PASMCs，傳至第3代時，性狀穩(wěn)定，通過顯微鏡觀察PASMCs進行形態(tài)學(xué)鑒別，免疫組織化學(xué)檢測SM-α-actin進行PASMCs鑒定(本研究細胞純度>95%)，本研究所用PASMCs為4～10代細胞。

1.5 實驗分組

本研究選用GW501516濃度為10～100 nmol/L，SC79濃度為10 μmol/L[11]。篩選GW501516抑制低氧PASMCs增殖最適濃度實驗分為5組，每組設(shè)6個復(fù)孔:對照組：0.1%DMSO；低氧組：0.1%DMSO+低氧；GW501516低、中、高劑量低氧組：不同濃度的GW501516 (10、30、100 nmol/L)+低氧。低氧及GW501516對PPARδ的表達的影響分為3組，每組設(shè)6個復(fù)孔：對照組：0.1%DMSO；GW501516組：100 nmol/L GW501516；低氧組：0.1%DMSO+低氧。GW501516抑制低氧PASMCs增殖機制相關(guān)實驗分為4組，每組設(shè)6個復(fù)孔：對照組：0.1%DMSO；低氧組：0.1%DMSO+低氧；GW501516低氧組：100 nmol/LGW501516+低氧；GW501516+SC79低氧組：100 nmol/LGW501516+10 μmol/L SC79+低氧。GW501516與SC79均溶解于DMSO儲存于-20℃，進一步使用時采用DMSO稀釋。對照組采用含21%氧氣，5%二氧化碳，74%氮氣培養(yǎng)，低氧組采用含 3%氧氣 、5%二氧化碳和92%氮氣培養(yǎng)[12]，當(dāng)細胞融合度達到70%左右時，采用不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24 h后分別進行常氧或低氧培養(yǎng)處理，GW501516低氧組與GW501516+SC79低氧組在低氧培養(yǎng)前給予GW501516或(和)SC79預(yù)處理2 h后進行干預(yù)。

1.6 CCK-8檢測細胞增殖

PASMCs以5×103cells/well均勻接種于96孔板中，每孔含培養(yǎng)基100 μl，各組細胞干預(yù)后,按照CCK-8試劑盒使用說明在96孔板每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育3 h，采用酶標(biāo)儀測定450 nm吸光度，計算細胞的相對增殖。

1.7 BrdU試劑盒檢測DNA的合成

PASMCs以5×103cells/well均勻接種于96孔板中，各組細胞干預(yù)后，每孔加入10 μl BrdU標(biāo)記液，孵育2 h后移去標(biāo)記液，按照試劑盒操作步驟依次加入FixDenat solution，anti-BrdU-POD工作液，Substrate solution后酶標(biāo)儀測定450 nm吸光度，計算DNA的相對含量。

1.8 流式細胞儀檢測細胞周期

PASMCs以 1.5×105cells/well均勻接種于6孔板中，各組細胞干預(yù)后，采用胰酶消化收集細胞，PBS洗滌后加入70%乙醇(無水乙醇+PBS溶液)固定過夜，離心后加入485 μl PBS重懸細胞、Triton X-100 1 μl、1 mg/ml RNA酶 5 μl、 1 mg/ml PI 10 μl，4℃避光孵育30 min后，通過流式細胞儀檢測細胞周期，modifit軟件分析數(shù)據(jù)。

1.9 RT-PCR檢測mRNA的表達

PASMCs以 1.5×105cells/well均勻接種于6孔板中，各組細胞干預(yù)后，使用TRIzol試劑提取總RNA，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，分光光度計測量RNA的質(zhì)量和濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再經(jīng)PCR技術(shù)擴增，以GAPDH作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化RNA的含量。所用引物序列為: CyclinD1: 上游 5'-GAGACCATCCCCCTGACGGC-3'，下游 5'-TCTTCCTCCTCCTCGGCGGC-3'；P27：上游 5'-TGCAACCGACGATTCTTCTACTCAA-3'，下游5'-CAAGCAGTGATGTATCTGATAAACAAGGA-3'；GAPDH：上游 5'-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3'，下游 5'-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'

1.10 Western blot檢測蛋白的表達

PASMCs以 1.5×105cells/well均勻接種于6孔板中，各組細胞干預(yù)后，通過細胞裂解液提取細胞總蛋白，通過BCA法測量樣本總蛋白濃度，變性后每個樣本取15 μg總蛋白進行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后依次進行封閉、漂洗、一抗孵育、二抗孵育，再次漂洗后Odyssey系統(tǒng)讀取蛋白的灰度值并進行結(jié)果統(tǒng)計。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 GW501516對低氧誘導(dǎo)的PASMCs增殖與DNA合成的影響

與對照組相比，低氧刺激PASMCs 12、24、48 h后，其增殖與DNA合成顯著增強(P<0.01)，不同濃度的GW501516(10、30、100 nmol/L)干預(yù)12、24、48 h后均能夠抑制PASMCs增殖與DNA合成，且GW501516抑制增殖與DNA合成具有濃度依賴性(P<0.05或P<0.01，表1, 表2)

Tab. 1 Effects of GW501516 on the proliferation of hypoxia exposed PASMCs n=6)

Tab. 2 Effects of GW501516 on the DNA synthesis of hypoxia exposed PASMCs n=6)

2.2 低氧及GW501516對PASMCs內(nèi)PPARδ的表達的影響

與對照組相比，GW501516(100 nmol/L)干預(yù)PASMCs 24 h能夠顯著上調(diào)PPARδ的表達[(1.00±0.15)比(2.48±0.21)](P<0.01)，而低氧可顯著下調(diào)PPARδ的表達[(1.00±0.15)比(0.28±0.04)](P<0.01，圖1 )。

Fig. 1 Effects of GW501516 and hypoxia on the expression of PPARδin PASMCs (n=6)

2.3 SC79逆轉(zhuǎn)GW501516對低氧誘導(dǎo)PASMCs增殖與DAN合成的影響

與對照組相比，低氧刺激24 h能夠明顯促進PASMCs增殖與DNA合成(P<0.01)，GW501516(100 nmol/L)干預(yù)能夠顯著抑制低氧誘導(dǎo)的PASMCs增殖與DNA合成(P<0.01)，SC79可逆轉(zhuǎn)GW501516對低氧誘導(dǎo)PASMCs增殖與DAN合成的抑制作用(P<0.01，表 3)。

Tab. 3 SC79 reversed the inhibition of cell proliferation and DNA synthesis by GW501516 in hypoxia stimulated PASMCs n=6)

2.4 SC79逆轉(zhuǎn)GW501516對PASMCs細胞周期阻滯的影響

與對照組相比，低氧處理PASMCs 24 h后其分裂增強，處于G0/G1期的PASMCs比例明顯減少(P<0.01)，而處于S期和G2/M期的PASMCs比例明顯增多(P<0.01)，與低氧組相比，GW501516(100 nmol/L)干預(yù)后PASMCs分裂減弱，處于G0/G1期的PASMCs比例增加(P<0.05)，而處于S期和G2/M期的PASMCs比例顯著減少(P<0.01)，而與GW501516低氧組相比，SC79能夠逆轉(zhuǎn)GW501516 阻滯細胞周期的作用(P<0.05或P<0.01，圖 2，表4)。

Fig. 2 SC79 reversed the effect of GW501516 on cell cycle progression in hypoxia exposed PASMCs (n=6)

Tab. 4 Quantification of cell percentage in different phases (%, n=6 )

2.5 SC79逆轉(zhuǎn)GW501516對Cyclin D1 mRNA的表達及p27 mRNA表達的影響作用

與對照組相比，低氧處理24 h后PASMCs內(nèi)Cyclin D1 mRNA的表達明顯增加，同時p27 mRNA的表達明顯下降(P<0.01)；GW501516 (100 nmol/L)干預(yù)可顯著抑制Cyclin D1的mRNA表達，同時促進p27 mRNA的表達(P<0.01)，而SC79能夠逆轉(zhuǎn)GW501516 上述作用(P<0.01，表 5)。

Tab. 5 SC79 reversed the effect of GW501516 on the mRNA expressions of cyclin D1 and p27，and the protein expressions of phosphorylated forms AKT and GSK3β in hypoxia stimulated PASMCs n=6)

2.6 SC79逆轉(zhuǎn)GW501516對AKT/GSK3β信號通路的抑制作用

與對照組相比，低氧處理可顯著促進PASMCs內(nèi)磷酸化的AKT與GSK3β表達(P<0.01)，與低氧組相比，GW501516(100 nmol/L)可顯著抑制酸化的AKT與GSK3β表達(P<0.01)，而SC79可逆轉(zhuǎn)GW501516抑制酸化的AKT與GSK3β表達的作用(P<0.01，圖 3 ,表5)。

Fig. 3 SC79 reversed the inactivating of AKT/GSK3β signaling pathway induced by GW501516 in hypoxia exposed PASMCs (n=6)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，低氧能夠下調(diào)PPARδ表達，PPARδ激動劑GW501516能夠通過抑制cyclin D1表達以及促進p27的表達阻滯細胞周期于G0/G1期，抑制低氧PASMCs增殖，同時GW501516能夠抑制AKT/GSK3β信號通路，而SC79能夠逆轉(zhuǎn)GW501516 上述作用。

前列環(huán)素(prostacyclin, PGI2)是一種內(nèi)生PPARδ激動劑，PGI2及其類似物在肺動脈高壓治療中已經(jīng)取得顯著進展[13]。然而有關(guān)PPARδ對低氧肺血管重構(gòu)的作用及機制尚不十分清楚。PASMCs異常增殖在低氧肺血管重構(gòu)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，抑制低氧PASMCs增殖能夠抑制低氧肺血管重構(gòu)緩解HPH[14]。體外培養(yǎng)PASMCs，建立低氧PASMCs增殖的細胞模型，是探索HPH和肺血管重構(gòu)發(fā)病機制的基礎(chǔ)[15,16]。本研究通過體外建立低氧PASMCs增殖的細胞模型發(fā)現(xiàn)，低氧能夠下調(diào)PASMCs中PPARδ表達，PPARδ激動劑GW501516能夠上調(diào)PPARδ表達，并且GW501516抑制低氧誘導(dǎo)的PASMCs增殖具有濃度依賴性。DNA的合成量能夠反映細胞增殖水平，本研究中BrdU試劑盒檢測DNA合成的結(jié)果表明，GW501516抑制低氧PASMCs內(nèi)DNA合成具有濃度依賴性。因此我們推測，低氧可通過抑制PPARδ表達促進PASMCs增殖細胞。在ox-LDL誘導(dǎo)VSMCs增殖實驗中發(fā)現(xiàn)GW501516能夠抑制VSMCs增殖，而通過RNA干擾或PPARδ抑制劑GSK0660抑制PPARδ的表達能夠逆轉(zhuǎn)GW501516抑制VSMCs增殖作用[7]。通過DL-炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine, PAG)抑制內(nèi)源性硫化氫誘導(dǎo)小鼠主動脈血管重構(gòu)與VSMCs增殖模型中發(fā)現(xiàn)，PAG能夠通過抑制PPARδ表達促進主動脈血管重構(gòu)與VSMCs增殖，而GW501516能夠抑制血管重構(gòu)以及VSMCs增殖[17]。PPARδ激動劑GW0742藥物涂層支架能夠抑制血管內(nèi)膜增生、支架術(shù)后再狹窄以及VSMCs增殖[18]。增殖受細胞周期調(diào)控，因此本研究檢測GW501516對PASMCs細胞周期的影響。流式細胞儀的結(jié)果表明，GW501516可以阻滯G0/G1期細胞向S期過渡，從而抑制細胞周期進程。細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)2和CDK4/6與Cyclin E和Cyclin D1形成復(fù)合物后促進G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化，而細胞周期蛋白激酶抑制蛋白p27能夠抑制該復(fù)合物活性抑制細胞周期進程[19,20]。本研究發(fā)現(xiàn)GW501516干預(yù)可抑制Cyclin D1的mRNA表達，同時促進p27 mRNA的表達。在PDGF誘導(dǎo)人PASMCs增殖細胞模型中，GW501516能夠拮抗PDGF-BB促進Cyclin D1，抑制P27表達的作用[21]。

AKT又名PKB,主要介導(dǎo)細胞分化、增殖、凋亡、肥大、增生等多種生理及病理過程，AKT抑制劑AZD5363可抑制VSMCs的增殖[22]。GSK3β是AKT重要下游蛋白，其通過磷酸化失活，抑制AKT/GSK3β信號通路從而抑制PASMCs 增殖[23,24]。研究表明GSK3β調(diào)控cyclin D1從細胞核轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)，從而被蛋白酶水解，在白三烯 B4 (LTB4)誘導(dǎo)PASMCs增殖模型中發(fā)現(xiàn)通過siRNA抑制GSK3β表達可上調(diào)cyclin D1[23]。低氧能夠通過活化AKT下調(diào)p27表達，誘導(dǎo)PASMCs增殖，而抑制AKT活化可上調(diào)p27的表達抑制低氧PASMCs增殖[25]。此外，抑制GSK3β活化可下調(diào)p27蛋白的表達[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，GW501516可抑制低氧誘導(dǎo)AKT/GSK3β信號通路的活化。在VSMCs中過表達PPARδ能夠抑制AKT磷酸化，PPARδ激動劑GW501516或GW0742能夠抑制AKT磷酸化[6,27]。另外本研究還發(fā)現(xiàn)，AKT激動劑SC79可逆轉(zhuǎn)GW501516抑制細胞增殖與DNA合成、阻滯細胞周期、調(diào)控Cyclin D1及p27的表達、抑制AKT/GSK3β信號通路活化等作用。因此推測GW501516通過抑制AKT/GSK3β信號通路抑制PASMCs的增殖。

綜上所述，PPARδ激動劑GW501516能夠通過抑制AKT/GSK3β信號通路抑制低氧誘導(dǎo)PASMCs增殖。GW501516有可能成為治療和預(yù)防低氧肺血管重構(gòu)相關(guān)疾病的新藥物。本研究僅在細胞模型上研究GW501516對低氧PASMCs增殖的影響及機制，尚未在動物模型中驗證GW501516對低氧肺血管重構(gòu)的影響。因此后一步本研究組將在低氧誘導(dǎo)肺動脈高壓大鼠模型上探討GW501516對肺血管重構(gòu)的影響。