閆 爍，馬寶慧

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院2018級(jí)研究生，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室；3.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所)

氟是一種廣泛存在于自然界中的元素，通常以化合物形式存在。人體攝入氟的主要來(lái)源包括飲水、飲茶、燃煤等，不同地區(qū)的人攝取氟的途徑各不同。一定量的氟對(duì)人體有益，如預(yù)防齲齒。但是，當(dāng)氟積累到一定程度后就會(huì)對(duì)全身各個(gè)器官造成損傷，包括骨相損傷和非骨相損傷。全世界有50多個(gè)國(guó)家和地區(qū)都存在氟化物超標(biāo)的問(wèn)題[1]。越來(lái)越多的研究表明，氟化物在體內(nèi)積累，對(duì)心血管等許多系統(tǒng)產(chǎn)生毒害作用，從而導(dǎo)致心室舒張功能障礙、外周血管疾病、主動(dòng)脈粥樣硬化和缺血性心臟病[2]。

目前研究證實(shí)，過(guò)量攝入氟化物會(huì)對(duì)人體造成傷害，因此對(duì)其損害機(jī)制的研究就變得尤為重要。研究表明，過(guò)量氟化物的攝入會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，過(guò)氧化損傷不僅能夠通過(guò)活性氧的直接作用造成腎損傷，還能導(dǎo)致下游凋亡、自噬等多種生物學(xué)行為。組織器官功能的損傷過(guò)程不僅涉及細(xì)胞過(guò)度凋亡，同時(shí)還與細(xì)胞過(guò)度自噬密切相關(guān)[3]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是調(diào)節(jié)自噬過(guò)程最重要的上游信號(hào)分子。缺氧、氧化應(yīng)激、中毒等外界刺激可激活mTOR信號(hào)通路所介導(dǎo)的細(xì)胞自噬過(guò)程，增加哺乳動(dòng)物ATG6同源蛋白(Beclin-1)的表達(dá)，并與多種Atg分子相互作用，參與自噬體的形成。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC-3)是自噬過(guò)程激活的標(biāo)志分子，自噬未激活時(shí)，LC-3及LC-3Ⅰ為主要存在形式，自噬激活時(shí)，LC-3Ⅰ向LC-3Ⅱ轉(zhuǎn)化。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT-3)可以被不同的細(xì)胞因子激活，在細(xì)胞因子-受體相互作用的過(guò)程中充當(dāng)載體，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化中起著重要作用。在生理性自噬過(guò)程中，細(xì)胞利用自身的溶酶體來(lái)降解受損的細(xì)胞器及大分子，既能清除損傷的大分子及細(xì)胞器，又能通過(guò)降解產(chǎn)物為細(xì)胞供能。但外界損傷因素的持續(xù)存在會(huì)造成自噬過(guò)程持續(xù)激活，進(jìn)而造成細(xì)胞發(fā)生損傷。本文利用大鼠H9c2心肌細(xì)胞建立氟中毒模型，研究不同濃度的氟化鈉對(duì)心肌細(xì)胞中自噬相關(guān)基因的變化。

1 對(duì)象與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料及分組 選用大鼠H9c2心肌細(xì)胞，購(gòu)于北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺(tái)。H9c2心肌細(xì)胞分為6組，分別為0 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L NaF組，各組均用相應(yīng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。

1.2方法 樣品中加入200 μL的Trizol，勻漿研磨成無(wú)顆粒狀，再以加入80 μL Trizol的針管來(lái)回抽吸，靜置5 min，4 ℃，12 000 g離心5 min。取上清加氯仿，4 ℃，12 000 g離心15 min。取上清加等比例異丙醇，4 ℃，1 000 g離心5 min。棄上清加預(yù)冷的75 %乙醇1 mL，4 ℃，10 000 g離心5 min。棄上清4 ℃，7 500 g空轉(zhuǎn)1 min。加入20 μL dd H2O溶解RNA，震蕩、離心，測(cè)定RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，于PCR儀擴(kuò)增后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。LC-3、Beclin-1、STAT-3 mRNA表達(dá)分析采用Tanon-500全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 Nanodrop-2000微量核酸蛋白定量?jī)x(美國(guó)Thermo Scientific)，2×Taq PCR預(yù)混試劑Ⅱ(天根)，PCR儀(美國(guó)Thermo Scientific)，Trizol細(xì)胞裂解液，氯仿，異丙醇，75 %乙醇，Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo scientific)。

1.4統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進(jìn)行分析。計(jì)量資料以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1氟化鈉對(duì)心肌細(xì)胞LC-3、Beclin-1 mRNA表達(dá)的影響 將H9c2心肌細(xì)胞加入含有NaF的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，心肌細(xì)胞LC-3和Beclin-1 mRNA表達(dá)量隨培養(yǎng)基中NaF濃度的增加而增加，見(jiàn)圖1-a、1-b。

圖1 氟化鈉處理心肌細(xì)胞48 h后LC-3 mRNA、STAT-3 mRNA、Beclin-1 mRNA表達(dá)量的變化

2.2氟化鈉對(duì)心肌細(xì)胞STAT-3 mRNA表達(dá)的影響 H9c2心肌細(xì)胞在染毒處理48 h后，STAT-3 mRNA表達(dá)量隨培養(yǎng)基中NaF濃度的增加而減少，見(jiàn)圖1-c。

3 討論

氟是鹵族元素中化學(xué)性質(zhì)較活潑的元素之一，是機(jī)體必需的微量元素，具有強(qiáng)負(fù)電性、高度破壞性。過(guò)量的氟可對(duì)機(jī)體軟組織系統(tǒng)造成損傷。心肌是氟中毒非骨相損傷非常重要的靶器官之一。越來(lái)越多的證據(jù)表明，心血管系統(tǒng)易攝入過(guò)量的氟化物，導(dǎo)致嚴(yán)重的功能障礙，例如心輸出量下降，誘發(fā)心律不齊和心臟傳導(dǎo)阻滯[4]。高濃度的氟化物可引起心肌細(xì)胞損傷，導(dǎo)致心室舒張功能障礙、周圍血管疾病、頸動(dòng)脈粥樣硬化和缺血性心臟病。然而，人們對(duì)氟中毒致心血管疾病發(fā)生的作用機(jī)制尚不清楚。我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，染毒的心肌細(xì)胞活力降低。

自噬是近年來(lái)生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。自噬是細(xì)胞通過(guò)一系列復(fù)雜過(guò)程將自身組成成分或外來(lái)入侵者進(jìn)行消化的過(guò)程，是細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)、抵抗逆境的一個(gè)重要機(jī)制。自噬是機(jī)體細(xì)胞的一種程序性死亡方式，也稱為Ⅱ型程序性死亡，參與細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、凋亡、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。LC-3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中自噬體的標(biāo)記蛋白，是目前觀察自噬現(xiàn)象是否存在，研究細(xì)胞自噬較為可靠的生物學(xué)標(biāo)志物[5]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，LC-3與ATG8是同源基因，LC-3的表達(dá)水平越高，則自噬水平越高。哺乳動(dòng)物中Beclin-1是參與自噬的另一種特異性基因，其與Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶(class-3-PI3K)形成復(fù)合物，從而參與自噬體的形成[6]。正常情況下，機(jī)體的自噬水平處于較低的范圍，當(dāng)機(jī)體受到某種刺激或處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，即被誘導(dǎo)發(fā)生自噬。不同程度的自噬對(duì)細(xì)胞的作用有很大區(qū)別，當(dāng)自噬發(fā)生程度低時(shí)自噬會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用，而過(guò)度自噬發(fā)生時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷[7]。本實(shí)驗(yàn)以H9c2大鼠心肌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，將H9c2細(xì)胞分別加入到含有2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L NaF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，H9c2心肌細(xì)胞中LC-3和Beclin-1 mRNA表達(dá)量隨NaF濃度的增加而增加，且高于對(duì)照組。徐淋等[8]研究顯示，氟中毒大鼠肝臟中LC-3、Beclin-1、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)、B細(xì)胞淋巴瘤/白細(xì)胞基因伴隨蛋白x(Bax)的蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明過(guò)量氟可激活大鼠肝組織中自噬和凋亡因子，自噬和凋亡可能共同參與慢性氟中毒所致肝臟損傷的發(fā)病過(guò)程。以前研究表明，細(xì)胞凋亡可能參與氟中毒引起的心肌細(xì)胞損傷，推測(cè)在氟致心肌細(xì)胞損傷時(shí)還有自噬的參與。

STAT-3是STATs家族的重要成員，也是細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子信號(hào)途徑的介導(dǎo)子。STAT-3廣泛表達(dá)于不同類型的細(xì)胞和組織中，參與細(xì)胞生長(zhǎng)分化、增生、惡性轉(zhuǎn)化及凋亡抑制等生理功能的調(diào)控[9]。劉亞麗等[10]及俞辰斌等[11]研究顯示，STAT-3是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化的重要因子，缺血再灌注損傷的心肌細(xì)胞及氧化應(yīng)激損傷的心肌細(xì)胞p-STAT3表達(dá)下調(diào)，激活大鼠心肌細(xì)胞JAK2/STAT3信號(hào)通路能夠抑制心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，阻斷STAT3的激活則增加細(xì)胞凋亡，細(xì)胞活力明顯下降。在本實(shí)驗(yàn)中，STAT-3 mRNA表達(dá)量隨NaF濃度的增加而降低，低于對(duì)照組，表明過(guò)量的氟可誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生，同時(shí)在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化中起著重要作用的STAT-3相對(duì)表達(dá)量下降，我們推測(cè)氟中毒可能引起自噬從而使心肌細(xì)胞活力降低。

綜上所述，過(guò)量的氟化物上調(diào)心肌細(xì)胞LC-3、Beclin-1 mRNA表達(dá)量，并下調(diào)STAT-3 mRNA表達(dá)量，推測(cè)氟化鈉導(dǎo)致心肌細(xì)胞活力降低可能與自噬的過(guò)度激活有關(guān)。