魏楚洪 鐘 華 文 芳 何思玲 張金鳳▲

1.廣東醫(yī)科大學(xué)順德婦女兒童醫(yī)院 （佛山市順德區(qū)婦幼保健院）新生兒疾病篩查中心，廣東佛山 528300；

2.廣東醫(yī)科大學(xué)順德婦女兒童醫(yī)院 （佛山市順德區(qū)婦幼保健院）檢驗(yàn)科，廣東佛山 528300

地中海貧血（thalassemia）是由珠蛋白基因缺陷導(dǎo)致珠蛋白鏈合成減少的一種常染色體隱性遺傳性疾病，主要有α地中海貧血（α地貧）和β地中海貧血（β地貧），嚴(yán)重者可致死，且嚴(yán)重影響新生兒的健康發(fā)育[1]。地中海貧血是我國(guó)南方發(fā)病率最高的單基因遺傳病[2]，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3-4]，廣東省α地貧基因攜帶率為8.53%，β地貧基因攜帶率為2.54%。為了解順德地區(qū)新生兒地中海貧血的分布情況，本研究對(duì)我院的新生兒血紅蛋白電泳及地貧基因檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2019年1月至2020年3月我院新生兒干血斑標(biāo)本9992例，男5318例，女4674例；項(xiàng)目經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，新生兒監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

1.2 材料與方法

1.2.1 標(biāo)本采集 新生兒出生后3～7 d，采足后跟血，從第二滴開始取血，血斑須完全滲透，直徑＞8 mm，禁止重復(fù)滴血，室溫平放晾干后密封存于4 ℃冰箱。

1.2.2 儀器與試劑 血紅蛋白電泳：法國(guó)Sebia全自動(dòng)毛細(xì)管電泳分析儀；配套試劑盒和校準(zhǔn)品。

地貧基因檢測(cè)：Abbott m2000 rt熒光定量PCR擴(kuò)增儀；試劑盒和校準(zhǔn)品由深圳亞能提供。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.3.1 血紅蛋白電泳 取3.8 mm標(biāo)本至稀釋杯中，加入50 μl蒸餾水溶解，置4 ℃冰箱過夜，次日取出放室溫30 min后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3.2 初篩陽性召回 α地貧初篩陽性召回進(jìn)行α地貧基因診斷，β地貧初篩陽性召回進(jìn)行α地貧和β地貧基因診斷[3]；異常血紅蛋白初篩陽性建議基因檢測(cè)或進(jìn)一步測(cè)序。

1.2.4 檢測(cè)指標(biāo) 血紅蛋白電泳：HbA、HbA2、HbBart's、HbE、HbC、HbS以及其他異常區(qū)帶（NX區(qū)）；α地貧基因檢測(cè)：--SEA、-α3.7、-α4.2、α（CS、QS、WS）等；β地貧基因診斷：17種β珠蛋白基因突變。

1.2.5 初篩陽性判讀標(biāo)準(zhǔn) α地貧初篩陽性：出現(xiàn)HbBart's帶。β地貧初篩陽性：①界值法，HbA＜9.5%。②綜合分析法，HbA≥9.5%且出現(xiàn)微量HbA2，HbA2/HbA比值增高[5]；異常血紅蛋白初篩陽性，出現(xiàn)HbE、HbC、HbS以及其他異常區(qū)帶（NX區(qū)）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件和Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。β地貧篩查HbA截?cái)嘀挡捎肦OC描述，計(jì)算AUC，根據(jù)約登指數(shù)確定HbA截?cái)嘀怠?/p>

2 結(jié)果

2.1 電泳及基因分型

9992例標(biāo)本初篩陽性1451例，陽性率為14.52%，召回做α地貧基因檢測(cè)607例，確診533例；進(jìn)行β地貧基因檢測(cè)246例，確診171例，αβ復(fù)合型地貧共13例。α地貧基因陽性率和符合率分別為5.33%（533/9992）、87.81%（533/607），主 要 基 因 型 為 缺 失 型--SEA（51.41%）、-α3.7（27.02%）、-α4.2（10.51%）；β地貧基因陽性率和符合率分別為1.71%（171/9992）、69.51%（171/246），主要基因型為βCD41-42（43.86%），見表1。

表1 地中海貧血基因型分析

2.2 α地貧篩查結(jié)果分析

不同HbBart's含量基因確診符合率如表2所示，儀器自動(dòng)判讀陽性標(biāo)本實(shí)際召回檢測(cè)565例，確診533例，符合率為94.34%，當(dāng)HbBart's＞1.0%時(shí)基因診斷符合率達(dá)98.12%（313/319）。

2.3 β地貧篩查結(jié)果分析

2.3.1 兩種判讀方法比較 臨界法基因確診符合率為62.07%，假陽性率為37.93%；綜合分析法基因確診符合率為87.50%，假陽性率為12.50%。兩種判讀方法結(jié)合應(yīng)用可提高β地貧篩查的檢出率，達(dá)69.51%。見表3。

表2 不同HbBart's水平確診率比較

表3 HbA臨界法與綜合分析法對(duì)β地貧篩查的判讀結(jié)果

2.3.2 β地貧篩查HbA閾值確定 根據(jù)HbA做ROC圖，AUC為0.923，95%置信區(qū)間（CI）為0.898～0.948；β地貧陽性確診組171例HbA水平為（9.83±4.30）%，陰性對(duì)照組749例HbA水平為（21.05±8.37）%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，t=22.315）。當(dāng)HbA值為13.15時(shí)，敏感性為84.7%，特異性為85.6%，約登指數(shù)最大，為0.703。見圖1。

圖1 HbA指標(biāo)篩查β地貧ROC曲線

2.4 其他異常血紅蛋白帶結(jié)果

其他異常血紅蛋白帶陽性共77例，初篩陽性率為0.77%，召回55例，召回率為71.43%（55/77），主要以N11區(qū)異常血紅蛋白帶和HbE為主；48例進(jìn)行常規(guī)基因診斷，陽性17例，見表4。

3 討論

地貧在我國(guó)南方為高發(fā)性遺傳性疾病，靜止型和輕型α地貧患者因無明顯臨床癥狀很易漏診，多數(shù)中間型α地貧患者有臨床貧血癥狀甚至需要輸血治療，重型α地貧為胎兒水腫綜合征極易致死，重型β地貧表現(xiàn)為嚴(yán)重溶血性貧血，須進(jìn)行輸血以維持生命，缺乏有效的地貧根治辦法是目前面臨的一個(gè)重大公共衛(wèi)生難題，嚴(yán)重威脅人類健康，給地貧患者家庭和社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3-4]。

表4 異常血紅蛋白帶結(jié)果

基因測(cè)序是診斷地貧的金標(biāo)準(zhǔn)，因其實(shí)驗(yàn)條件、檢測(cè)成本高，無法大規(guī)模開展篩查，需尋找性價(jià)比高且可大規(guī)模開展的篩查方法[6-9]，干血斑全自動(dòng)毛細(xì)管血紅蛋白電泳法具有較高的敏感性及特異性，結(jié)果較為準(zhǔn)確，經(jīng)濟(jì)方便，可大范圍篩查，該技術(shù)是目前篩查新生兒地貧的有效方式之一[10-11]。本研究對(duì)順德區(qū)新生兒采用全自動(dòng)毛細(xì)管血紅蛋白電泳技術(shù)進(jìn)行地貧篩查，并以基因結(jié)果為參照進(jìn)行分析，其陽性初篩率為14.52%，低于茂名地區(qū)的16.54%[12]，高于東莞地區(qū)的10.19%[13]；α地貧基因陽性率和符合率分別為5.33%和87.81%；β地貧基因陽性率和符合率分別為1.71%和69.51%，初篩陽性結(jié)果與基因檢測(cè)結(jié)果之間的一致性較好。

研究結(jié)果還顯示，本地區(qū)α地貧主要基因型為--SEA、-α3.7和-α4.2，與梁玉全等[14]的研究一致；β地貧基因型以βCD41-42為主，與萬志丹等[15]的研究一致；確診率低于全國(guó)平均水平，說明不同地區(qū)之間地貧發(fā)病率存在差異[3-4]；部分家屬通過咨詢了解得知輕型地貧危害性不大，考慮到嬰兒尚小不愿再次抽血復(fù)查，使確診病例減少，確診率偏低。

HbBart's含量為0.1%的標(biāo)本共42例，是結(jié)合母親血常規(guī)MCV、考慮到靜止型地貧缺乏臨床癥狀容易漏篩，人工判讀初篩陽性，而召回基因檢測(cè)結(jié)果全部為陰性，說明儀器自動(dòng)判讀陰性結(jié)果準(zhǔn)確性較高；HbBart's含量大于1.0%而常規(guī)地貧基因陰性標(biāo)本有6例，考慮為罕見型地貧，建議家屬進(jìn)行罕見地貧基因檢測(cè)或基因測(cè)序；儀器自動(dòng)判讀陽性標(biāo)本基因確診符合率達(dá)94.34%，說明毛細(xì)管電泳法具有較高的敏感性和特異性。

本研究共確診β地貧171例，其中界值法初篩陽性174例，確診108例，基因確診符合率為62.07%，假陽性率達(dá)37.93%，主要集中在HbA含量為7.5% ～ 9.5%，其假陽性率達(dá)57.69%；導(dǎo)致假陽性增高的主要原因是部分臨近足月新生兒電泳HbA偏低；綜合分析法判讀72例，確診63例，基因確診符合率為87.50%，假陽性率為12.50%；而兩種方法結(jié)合應(yīng)用明顯提高了基因確診率，達(dá)69.51%，降低了假陽性率，本研究結(jié)果與黃爍丹等[5]報(bào)道的一致。運(yùn)用ROC工作曲線確定本實(shí)驗(yàn)室β地貧篩查HbA截?cái)嘀担珹UC為0.923，95%CI為0.898～0.948，當(dāng)HbA值為13.15時(shí)，敏感性為84.7%，特異性為85.6%，約登指數(shù)最大為0.703，本研究得出的HbA截?cái)嘀担?.5，可能是因?yàn)檠芯繕?biāo)本量偏少，且其中部分篩查陽性是結(jié)合綜合分析法判讀而來，從而導(dǎo)致HbA閾值升高，今后將持續(xù)改進(jìn)，累計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，優(yōu)化HbA截?cái)嘀怠?/p>

異常血紅蛋白帶主要以N11區(qū)和HbE為主，常規(guī)基因診斷陽性17例，由于本院未開展罕見型地貧基因檢測(cè)和基因測(cè)序，考慮到多數(shù)異常血紅蛋白并不致病，多數(shù)家屬放棄進(jìn)一步基因測(cè)序，通過知情告知和自愿原則，本研究外送三份異常血紅蛋白陽性標(biāo)本，結(jié)果檢測(cè)到Hb G-Honolulu、Hb J-Wenchang-Wuming、Hb Queens各1例。

綜上所述，全自動(dòng)毛細(xì)管電泳法篩查聯(lián)合地貧基因檢測(cè)，能有效檢出本地區(qū)新生兒地貧患兒；本地區(qū)新生兒地貧發(fā)病率高，在預(yù)防干預(yù)中應(yīng)給予高度重視；由于人力、時(shí)間及技術(shù)水平等的限制，以及標(biāo)本來源僅限于本院，研究結(jié)果可能會(huì)存在一定的偏差，針對(duì)存在的問題，研究小組將結(jié)合本地區(qū)實(shí)際情況逐步進(jìn)行完善，促進(jìn)研究水平，爭(zhēng)取將該項(xiàng)目進(jìn)行全區(qū)推廣，為本地區(qū)新生兒地貧的診斷和預(yù)防保健工作提供科學(xué)數(shù)據(jù)。