楊濤，蘇忠，楊奕，劉劍，李高巖

(秦皇島市第一醫(yī)院 普外科，河北 秦皇島 066000)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見的消化道腫瘤之一，其發(fā)病機制尚未完全明確，嚴重影響人的生命健康并給家庭及社會帶來沉重的負擔(dān)。HCC具有易侵襲、易轉(zhuǎn)移的特點，雖然近年來肝癌的診療技術(shù)有了飛速發(fā)展，但是HCC患者5年生存率仍未見明顯提高[1]。尋找HCC新型分子生物學(xué)標志物是基礎(chǔ)及臨床研究的重點。既往研究發(fā)現(xiàn)，細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的蛋白水解是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，而基質(zhì)金屬蛋白酶14(matrix metalloprotease 14，MMP14)被證實在此過程中發(fā)揮重要作用[2]。MMP14也被稱為膜型1 MMP(MT1- MMP)，是MMP家族新成員，能夠參與細胞基底膜和ECM的降解，促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。MMP14通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與HCC的侵襲和遠處轉(zhuǎn)移[4]。本研究旨在探討HCC組織中MMP14的表達水平及其與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

選取2008年6月至2013年5月本院手術(shù)切除的248例HCC癌組織標本及其配對的癌旁組織標本(距離癌組織邊緣≥5 cm)。納入標準：(1) 術(shù)前未接受放療、化療或免疫治療；(2) 術(shù)后病理學(xué)檢查確診為HCC；(3) 病歷資料完整。排除標準：(1) 合并其他部位腫瘤；(2) 隨訪資料不全。其中男173例，女75例；年齡43～71歲，平均(53.78±16.09)歲；HBsAg陽性179例；有肝門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移140例；低分化139例，中高分化109例；TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期111例，Ⅲ～Ⅳ期137例。將術(shù)中切取的組織分成兩部分:一部分凍存于-70 ℃冰箱，用于Western blotting檢測；另一部分用福爾馬林固定并用石蠟包埋，用于免疫組織化學(xué)染色。

1.2 Western blotting檢測組織中MMP14的表達水平

隨機選取6例HCC癌組織及其配對的癌旁組織進行檢測。取組織100 g，冰上充分研碎后加入蛋白裂解液(武漢博士德生物工程有限公司)，以12 000 r·min-1離心15 min，收集上清液。用BCA試劑盒(美國Pierce公司)檢測蛋白濃度，隨后進行10% SDS- PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用脫脂奶粉封閉1 h，孵育一抗(MMP14單克隆抗體，稀釋500倍，美國Sigma公司)，4 ℃過夜后棄去一抗。溫室孵育二抗(羊抗兔IgG，稀釋2 000倍，美國Sigma公司)，2 h后棄去二抗。以GAPDH作為內(nèi)參，用ECL發(fā)光儀成像，最后采用Image J軟件分析灰度值，計算蛋白相對表達量。

1.3 免疫組織化學(xué)染色法檢測組織中MMP14表達水平

石蠟切片由本院病理科制備，切片厚度為4 μm。檢測所有HCC癌組織及癌旁組織中MMP14的表達水平。檢測時常規(guī)脫蠟至水，隨后放入預(yù)熱的檸檬酸緩沖液中，高壓處理2 min，冷卻至室溫。滴加3%過氧化氫溶液除去內(nèi)源性過氧化物酶，溫室孵育10 min。滴加MMP14單克隆抗體(稀釋500倍)，4 ℃過夜。滴加生物素標記的羊抗兔IgG。最后用DAB顯色，蘇木紫復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、干燥、封片。在顯微鏡下觀察細胞染色強度和陽性細胞比例。染色強度：陰性為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。陽性細胞比例：0%～10%為1分；11%～50%為2分；51%～80%為3分；81%～100%為4分。將以上兩個評分相乘，0分為MMP14陰性表達；1～3分為弱陽性表達；4～8分為中等陽性表達；9～12分為強陽性表達。0～3分為MMP14低表達；4～12分為MMP14高表達。

1.4 隨訪

術(shù)后對所有患者進行門診及電話隨訪。前2年每3個月隨訪1次；第3年后每半年隨訪1次。隨訪時進行血清甲胎蛋白、腹部B超、CT或MRI檢查。隨訪截至2019年7月。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均值±標準差表示，兩組間比較用t檢驗；計數(shù)資料的比較用卡方檢驗。生存分析用Kaplan- Meier法，建立Cox比例風(fēng)險回歸模型分析影響HCC的因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Western blotting檢測組織中MMP14的表達

HCC癌組織中MMP14蛋白相對表達量為0.91±0.08，明顯高于癌旁組織的0.24±0.08(P<0.05)，見圖1。

1.癌組織；2.癌旁組織

2.2 免疫組織化學(xué)染色法檢測組織中MMP14

MMP14主要定位于細胞質(zhì)中，在癌組織中高表達，在癌旁組織中呈陰性或弱陽性表達(圖2)。癌組織中MMP14表達率為62.10%(154/248)，明顯高于癌旁組織的26.61%(66/248)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=63.258,P<0.001)。

A.癌旁組織；B.癌組織

2.3 癌組織中MMP14表達與HCC臨床病理特征的關(guān)系

MMP14與HCC分化程度及TNM分期有關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡、HBsAg、甲胎蛋白水平、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量和肝門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)，見表1。

2.4 影響HCC患者預(yù)后的單因素和多因素分析

以患者是否存活或是否無瘤存活作為因變量，性別、年齡、腫瘤大小、甲胎蛋白水平、HBsAg、腫瘤數(shù)量、肝門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、臨床分期和MMP14表達水平為自變量，進行Cox多因素分析。結(jié)果顯示，腫瘤低分化、高TNM分期和MMP14高表達是HCC患者總生存期和無瘤生存期的獨立影響因素(P<0.05)，見表2、3。

2.5 MMP14與HCC患者生存預(yù)后的關(guān)系

MMP14高表達患者的總體生存時間和無瘤生存時間明顯短于低表達患者(P值分別為0.008和0.004，Log- Rank檢驗)，見圖3。

3 討 論

肝癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，死亡率較高，其發(fā)病與遺傳、環(huán)境、病毒感染、體質(zhì)等有關(guān)。肝癌患者預(yù)后較差的原因是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而MMP又與兩者密切相關(guān)。因此，探討MMP與肝癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系有重要意義。MMP是一組鋅依賴性內(nèi)肽酶，除可以降解細胞外基質(zhì)外，還可以作用于蛋白激酶、生長因子、細胞表面分子和細胞趨化因子等[5]。MMP在生理狀態(tài)及癌癥進展時細胞外基質(zhì)重塑過程中起重要作用[6]。MMP14也被稱為MT1- MMP，是MMP家族新成員，被認為是MMP家族中與腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移最為相關(guān)的酶[7]。MMP14與宮頸癌[8]、胃癌[9]、結(jié)直腸癌[10]、肺癌[11]等的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，HCC癌組織中MMP14蛋白表達水平明顯高于癌旁組織，并且其表達水平與HCC分化程度、TNM分期有關(guān)，提示MMP14可能參與了HCC的發(fā)生和進展。

表1 MMP14與HCC臨床病理特征的關(guān)系例

腫瘤的進展與腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)。MMP14參與腫瘤進展的機制[12- 15]可能為：(1) 降解Ⅰ～Ⅲ型膠原、纖維粘連蛋白、蛋白多糖和纖維素等細胞外基質(zhì)；(2) 激活MMP2、MMP13，使蛋白水解效應(yīng)放大；(3) 通過與細胞黏附分子作用，影響細胞在細胞外基質(zhì)上的遷移；(4) 上調(diào)血管生成因子表達，促進血管形成，進而促進腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移；(5) 促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進而影響腫瘤細胞的侵襲和遷移。

影響HCC預(yù)后的因素較多。本研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤低分化、高TNM分期是HCC患者總生存期和無瘤生存期較短的獨立影響因素。這與既往報道[16- 18]一致。增殖和侵襲是影響癌癥患者生存預(yù)后的重要因素，而MMP14又參與了此過程，因此MMP14可能有助于預(yù)測HCC的預(yù)后。MMP14與結(jié)直腸癌[10]、膀胱癌[19]、胃癌[9]及乳腺癌[20]等的生存預(yù)后有關(guān)。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，高MMP14表達的HCC患者的生存預(yù)后較差，并且MMP14是影響HCC患者總生存期和無瘤生存期的獨立因素。

在治療方面，MMP14與乳腺癌放療及化療的敏感性有關(guān)[21]。Ager等[22]也發(fā)現(xiàn)，阻斷MMP14可降低免疫抑制性轉(zhuǎn)化生長因子β，抑制小鼠乳腺癌腫瘤生長，并且對放療的反應(yīng)性增強。因此，可以推測，MMP14可能與HCC的放化療敏感性有關(guān)，但是本研究并未對此進行分析，需要未來進一步探討。

表2 HCC患者總生存期的單因素和Cox多因素分析

表3 HCC患者無瘤生存期的單因素和Cox多因素分析

圖3 MMP14與HCC患者總生存期及無瘤生存期的關(guān)系(Kaplan- Meier生存曲線)

綜上所述，HCC癌組織中MMP14表達水平明顯高于癌旁組織。MMP14表達水平與HCC分化程度及TNM分期有關(guān)。MMP14是HCC預(yù)后的獨立影響因素，其表達水平越高，患者總生存期和無瘤生存期越短。本研究也存在一些局限性:未檢測患者血清中MMP14的表達水平，MMP14早期診斷及鑒別診斷HCC的價值須進一步分析；未探討MMP14在HCC中的作用機制，需要今后深入分析。