陳麗莎，徐永成，曾書君，陳惠新

(中山大學(xué)附屬惠州市中心人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，廣東 惠州 516000)

近年來涌現(xiàn)了大量的關(guān)于表觀遺傳修飾、DNA損傷反應(yīng)、腫瘤發(fā)生發(fā)展三者之間關(guān)系的研究，其中包括是否可通過調(diào)節(jié)組蛋白甲基化修飾狀態(tài)改變腫瘤細(xì)胞對(duì)DNA損傷的反應(yīng)，從而降低腫瘤的耐藥性。磷酸化H2AX(serine 139，γH2AX)是反映DNA損傷的重要指標(biāo)，為細(xì)胞發(fā)生最嚴(yán)重的DNA損傷—DNA雙鏈斷裂(DNA double- strand break, DSB)的標(biāo)志[1]。對(duì)結(jié)腸癌的研究[2]顯示，含Jumonji結(jié)構(gòu)域的蛋白2B(Jumonji domain- containing protein 2B, JMJD2B)可通過STAT3信號(hào)通路調(diào)節(jié)DNA損傷反應(yīng)，但JMJD2B在胃癌中是否也可通過調(diào)節(jié)DNA損傷反應(yīng)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，尚無相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細(xì)胞株MGC803、SGC7901來自惠州市中心人民醫(yī)院消化實(shí)驗(yàn)室。胎牛血清及RPMI- 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。JMJD2B siRNA、陰性對(duì)照siRNA(與任何靶基因無序列同源性)購(gòu)自上海吉瑪公司。一抗：兔抗JMJD2B單克隆抗體(美國(guó)Bethyl Laboratories公司)、兔抗phorsphor- H2AX(Ser 139)多克隆抗體(美國(guó)Millipore公司)、兔抗α- tubulin抗體(內(nèi)參照，美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；二抗：山羊抗兔 HRP(上?？党晒?。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 對(duì)MGC803、SGC7901細(xì)胞使用含10%胎牛血清的RPMI- 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，并置于恒溫37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱，95%濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞種植于6孔板中，按細(xì)胞2×105孔-1進(jìn)行接種，24 h后待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度約50%時(shí)，將JMJD2B siRNA或陰性對(duì)照siRNA使用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染，48 h后收集細(xì)胞或進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 彗星實(shí)驗(yàn) 采用0.25%胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1 000 r·min-1離心10 min，PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104ml-1。使用彗星實(shí)驗(yàn)試劑盒(Comet assay,北京博樂通生物科技有限公司)，取100 μl 0.5%正常熔點(diǎn)瓊脂糖鋪于磨砂載玻片上，蓋上蓋玻片，置于冰上固化5～10 min；移去蓋玻片，在第一層膠上鋪上100 μl 0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖與10 μl細(xì)胞懸液(約500個(gè)細(xì)胞)的混合液，蓋上蓋玻片，置于冰上固化5～10 min；移去蓋玻片，細(xì)胞裂解2.5 h，電泳緩沖液中放置20 min使DNA解鏈，電泳25 min，中和，DAPI 染色，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.4 Western blotting 細(xì)胞轉(zhuǎn)染JMJD2B siRNA或陰性對(duì)照siRNA 48 h后，以0.25%胰蛋白酶消化收集，離心抽提蛋白，BCA蛋白定量試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)進(jìn)行蛋白定量。取50 μg蛋白，進(jìn)行SDS- PAGE電泳分離，穩(wěn)壓冰浴電轉(zhuǎn)至NC膜，5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜、二抗孵育1 h，常規(guī)ECL曝光，掃描蛋白條帶，進(jìn)行灰度分析。

1.2.5 Cell Counting Kit- 8(CCK- 8)實(shí)驗(yàn) 于96孔板中按5×103孔-1接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC803、SGC7901細(xì)胞，每孔200 μl，24 h 后待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度約50%時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA，分別于48、72 h后收集細(xì)胞進(jìn)行CCK- 8實(shí)驗(yàn)。設(shè)不含細(xì)胞、只含培養(yǎng)基的空白組、陰性對(duì)照siRNA組和JMJD2B siRNA組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。按照CCK- 8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)說明書操作，以酶標(biāo)儀讀取各孔450 nm波長(zhǎng)處吸光度值(A值)。

1.2.6 細(xì)胞周期分析 培養(yǎng)MGC803、SGC7901細(xì)胞24 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組分別轉(zhuǎn)染siRNA 48 h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。用0.25%胰蛋白酶消化、收集細(xì)胞，預(yù)冷體積分?jǐn)?shù)70%乙醇4 ℃固定過夜，PBS洗滌，加入100 U·ml-1RNA酶A(D202，TaKaRa公司)1 ml，37 ℃水浴30 min，加入含Triton X- 100(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)的50 g·ml-1碘化丙啶染液(propidium iodide，PI，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)0.5 ml，4 ℃避光30 min，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.7 細(xì)胞凋亡分析 培養(yǎng)MGC803、SGC7901細(xì)胞24 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組分別轉(zhuǎn)染siRNA 48 h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。按照Annexin V Apoptosis Detection Kit I(美國(guó)BD Pharmingen公司)說明書操作，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 沉默人胃癌細(xì)胞JMJD2B的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生DNA損傷反應(yīng)

人胃癌細(xì)胞株MGC803、SGC7901于相同條件下培養(yǎng)，并分別給予陰性對(duì)照siRNA、JMJD2B siRNA的處理，采用Western blotting檢測(cè)DNA損傷特異性標(biāo)志物γH2AX的表達(dá)，同時(shí)應(yīng)用彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DNA損傷情況，結(jié)果均顯示沉默JMJD2B表達(dá)的人胃癌細(xì)胞發(fā)生DNA損傷(圖1)。

圖1 沉默人胃癌細(xì)胞JMJD2B的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生DNA損傷反應(yīng)

2.2 沉默人胃癌細(xì)胞JMJD2B的表達(dá)對(duì)增殖的影響

對(duì)轉(zhuǎn)染JMJD2B siRNA的MGC803、SGC7901細(xì)胞行CCK- 8實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組相對(duì)存活率低于陰性對(duì)照組(圖2)，說明沉默JMJD2B表達(dá)的人胃癌細(xì)胞的增殖明顯受到抑制。

圖2 沉默人胃癌細(xì)胞JMJD2B的表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響

2.3 沉默人胃癌細(xì)胞JMJD2B的表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期分布的影響

對(duì)轉(zhuǎn)染JMJD2B siRNA的MGC803、SGC7901細(xì)胞分別行流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果顯示，MGC803細(xì)胞發(fā)生G0/G1期細(xì)胞周期阻滯，而SGC7901細(xì)胞發(fā)生G2/M期細(xì)胞周期阻滯(圖3)，說明沉默JMJD2B表達(dá)誘導(dǎo)了細(xì)胞周期阻滯的發(fā)生，從而抑制細(xì)胞的增殖。

圖3 沉默人胃癌細(xì)胞JMJD2B的表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期的影響

2.4 沉默人胃癌細(xì)胞JMJD2B的表達(dá)對(duì)凋亡的影響

對(duì)轉(zhuǎn)染JMJD2B siRNA的MGC803、SGC7901細(xì)胞行流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果顯示，凋亡細(xì)胞比例明顯上升(圖4)，說明沉默JMJD2B的表達(dá)誘導(dǎo)了細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而抑制細(xì)胞的增殖。

圖4 沉默人胃癌細(xì)胞JMJD2B的表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

3 討 論

組蛋白甲基化修飾以及DNA損傷反應(yīng)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用早有研究，近年來關(guān)于兩者之間的相互關(guān)系在腫瘤中的研究[3- 4]越來越多。本研究結(jié)果顯示，沉默人胃癌細(xì)胞組蛋白去甲基化酶JMJD2B的表達(dá)可誘導(dǎo)DNA損傷反應(yīng)的發(fā)生(圖1)。在腫瘤早期，人體細(xì)胞通過誘導(dǎo)DNA損傷反應(yīng)來抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而DNA損傷反應(yīng)則通過激活信號(hào)通路來維持基因組的穩(wěn)定性，其中包括：(1) 由DNA損傷修復(fù)蛋白介導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行DNA損傷修復(fù)，細(xì)胞發(fā)生周期阻滯；(2) 更嚴(yán)重的DNA損傷會(huì)進(jìn)入p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑[5]。人胃癌細(xì)胞發(fā)生DNA損傷反應(yīng)后，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡的細(xì)胞比例增加(圖3、4)。然而，在腫瘤細(xì)胞中改變組蛋白甲基化修飾狀態(tài)誘導(dǎo)DNA損傷的具體機(jī)制尚未闡明。

組蛋白甲基化修飾在DNA損傷反應(yīng)的很多環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用，包括解開高度有序的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)、募集蛋白質(zhì)至DSB位點(diǎn)以及促進(jìn)DNA斷裂修復(fù)過程等。細(xì)胞發(fā)生DSB時(shí)，組蛋白翻譯后修飾在誘導(dǎo)及調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)損傷的反應(yīng)中至關(guān)重要。沉默組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2的表達(dá)可激活細(xì)胞發(fā)生DNA損傷反應(yīng)[6]，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SET7和去甲基化酶LSD1均可通過調(diào)節(jié)UHRF1的甲基化水平在DSB修復(fù)中發(fā)揮重要作用[7]。H3K9me3去甲基化酶JMJD2D和JMJD2A通過下調(diào)H3K9me3的甲基化水平，抑制了Tip60激活A(yù)TM介導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)，磷酸化ATM下調(diào)，其介導(dǎo)的p53和chk2磷酸化受抑制，DNA損傷反應(yīng)異常，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化甚至癌變。抑制組蛋白去甲基化酶PHF2的表達(dá)可上調(diào)DNA復(fù)制相關(guān)基因啟動(dòng)子上H3K9me3的水平，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生DNA損傷[8- 9]。抑制JMJD2B可誘導(dǎo)DNA損傷反應(yīng)介導(dǎo)的p21和PIG3的表達(dá)，同樣，細(xì)胞發(fā)生DNA損傷后，JMJD2B作為p53的靶基因在調(diào)節(jié)DNA損傷反應(yīng)中亦發(fā)揮重要作用[10]。

然而，組蛋白甲基化在DNA損傷反應(yīng)及修復(fù)過程發(fā)揮作用的機(jī)制尚不十分清晰。細(xì)胞在受到電離輻射后會(huì)發(fā)生DNA損傷，通過抑制組蛋白去甲基化酶KDM2B的活性，組蛋白H3賴氨酸36二甲基化水平增加，DSB位點(diǎn)上含Ku70的DNA- PK募集增加，DNA損傷修復(fù)途徑NHEJ被激活，發(fā)生放療抵抗，細(xì)胞存活率提高[11]。接受電離輻射的細(xì)胞通過抑制JMJD2B或甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39H1的表達(dá)可延緩結(jié)構(gòu)性異染色質(zhì)DNA修復(fù)的進(jìn)程，進(jìn)而降低細(xì)胞存活率[12]。臨床上，腦膠質(zhì)瘤易復(fù)發(fā)，同時(shí)放化療抵抗率高，而使用H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶G9a特異性抑制劑BIX- 01294可提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放療敏感性，其機(jī)制包括抑制DSB的修復(fù)[13]，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡。目前使用的很多化療藥屬于DNA損傷藥物。Mar等[14]報(bào)道，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SETD2突變可通過影響細(xì)胞對(duì)DNA損傷的識(shí)別，誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì)DNA損傷藥物的耐藥性。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶MMSET調(diào)節(jié)H4K20甲基化水平，有利于53BP1募集至DSB位點(diǎn)[15]；同樣，抑制H3K79甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L的表達(dá)，也抑制了53BP1募集至DSBs位點(diǎn)[16- 17]，細(xì)胞發(fā)生DNA損傷，利用該特點(diǎn)在結(jié)直腸癌細(xì)胞中使用siRNA或小分子抑制劑抑制DOT1L的表達(dá)可通過調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)途徑，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性[18]。

JMJD2B是抗腫瘤藥物作用的重要靶點(diǎn)[19]。在耐順鉑的人非小細(xì)胞肺癌[20]細(xì)胞中，JMJD2家族，特別是JMJD2B的表達(dá)明顯上調(diào)，而使用JMJD2家族蛋白的特異性抑制劑可增加癌細(xì)胞對(duì)順鉑的反應(yīng)[21]。本研究結(jié)果顯示，抑制JMJD2B可誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞發(fā)生DNA損傷，抑制癌細(xì)胞的惡性表型。因此，進(jìn)一步深入研究JMJD2B與DNA損傷反應(yīng)之間的關(guān)系和機(jī)制，有望可減少腫瘤的放化療抵抗性。