蔣露，周靜，唐姣

(湖南省婦幼保健院 婦產(chǎn)科，湖南 長沙 410008)

宮頸癌是世界第三大常見的女性癌癥，每年新增56.9萬例，其中265 700例死亡[1]。近年來，宮頸癌的發(fā)病呈年輕化趨勢，并且發(fā)病率逐漸升高，嚴重威脅到患者的心身健康[2]。早期診治對提高宮頸癌患者的生存時間及生命質(zhì)量有重要意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是長度為18～25 nt的非編碼RNA，參與基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控。既往研究[3- 4]已證實，miRNA廣泛參與了細胞的增殖、分化、凋亡等生物學過程，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用。miRNA- 223與宮頸癌在內(nèi)的多種癌癥進展有關[5- 8]。外泌體是活細胞分泌的納米級囊泡小體，內(nèi)含豐富的蛋白質(zhì)、miRNA和lncRNA等,可以在細胞間轉(zhuǎn)運，從而調(diào)節(jié)細胞的生物學功能[9]。本研究檢測了宮頸癌患者血清外泌體miRNA- 223的表達水平，旨在探討miRNA- 223在宮頸癌早期診斷及預后評價中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月至2014年1月本院收治的168例宮頸癌患者為研究對象(宮頸癌組)，均經(jīng)過組織病理學檢查確診。行根治性子宮切除術和盆腔淋巴結切除術治療，所有患者術前均未接受過放化療。術前采集外周血5 ml，分離血清，用于提取外泌體miRNA- 223。另選取同期在本院進行健康體檢的160例正常者為對照(對照組)，于體檢當日采血。本實驗經(jīng)本院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血清外泌體的分離及鑒定 取宮頸癌患者血清1 ml，在4 ℃下以2 000 r·min-1離心15 min，取上清液。加入外泌體分離試劑(美國Sigam公司)，于4 ℃下靜置15 min，以15 000 r·min-1離心2 min，棄去上清液，所留沉淀物即為外泌體，以50 μl的磷酸鹽緩沖液進行重懸，分裝后用于后續(xù)實驗。

取10 μl外泌體加于銅網(wǎng)上沉淀1 min，用濾紙吸盡浮液。滴加10 μl濃度為2%的醋酸雙氧鈾(上海鼓臣生物技術有限公司)于銅網(wǎng)上沉淀1 min，用濾紙吸盡浮液。常溫下干燥10 min，用Tecnai G2 Spirit 120 kV透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)。

用Western blotting法檢測外泌體標志物TSG101和CD63的表達[10]。在外泌體中加入RIPA細胞裂解液(北京藍博斯特生物技術有限公司)，提取蛋白。用BCA試劑盒(上海一研生物科技有限公司)進行蛋白定量檢測，隨后進行SDS- PAGE凝膠電泳，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉，加入抗CD63小鼠單克隆抗體(1∶200，美國Invitrogen公司)或抗TSG101兔單克隆抗體(1∶10 000，美國Sigma公司)，4 ℃搖床過夜。TBST洗滌3次后加入山羊抗兔IgG- HRP(1∶10 000，美國ABCAM)或兔抗鼠IgG- HRP(1∶10 000，美國ABCAM)。最后用ECL顯影。

1.2.2 RT- PCR檢測血清外泌體miRNA- 223的表達量 用miRNAOUT試劑盒(美國Sigam公司)提取miRNA，隨后進行miRNA逆轉(zhuǎn)錄。本研究的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司設計并提供。miRNA- 223上游引物為5′- CTGAGTTGGACACTCCATGTGGTAGAGTGTCA- 3′，下游引物為5′- ATCCAGTACAGGGTCCGAGG- 3′。內(nèi)參U6 snRNA上游引物為5′- CTCGCTTCGGCAGCACATATACT- 3′,下游引物為5′- ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC- 3′。用RT- PCR試劑盒(美國Sima公司)檢測miRNA相對表達量，檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。用2-ΔΔCT公式計算miRNA- 223的表達量。以miRNA- 223表達的中位數(shù)為截斷值，將宮頸癌患者分為高表達組和低表達組。

1.2.3 病例資料采集 回顧性分析所有宮頸癌患者的臨床資料，包括年齡、腫瘤大小、組織學分級、組織學類型、FIGO分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、宮頸浸潤深度。

1.2.4 隨訪 采用電話及門診對所有宮頸癌患者進行隨訪。術后半年內(nèi)，每3個月隨訪1次；此后，每半年隨訪1次?？偵嫫?overall survival，OS)定義為術后第1天至死亡或最后1次隨訪。無病生存期(disease- free survival，DFS)定義為術后開始至癌癥復發(fā)或由于疾病進展導致患者死亡的時間[11]。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料采用例表示，組間比較用χ2檢驗；用受試者工作特征(ROC)曲線分析miRNA- 223診斷宮頸癌的價值，計算曲線下面積(AUC)、靈敏度和特異度；用Kaplan- Meier法繪制生存曲線，生存率比較采用Log- Rank檢驗；多因素分析采用Cox比例風險模型。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 血清外泌體鑒定

電鏡下可見外泌體呈圓形囊泡狀，直徑50～150 nm(圖1)。Western blotting檢測到外泌體表面標志物CD63和TSG101的表達(圖2)。宮頸癌組和對照組73%的外泌體囊泡直徑為50～150 nm，27%的直徑<50 nm。

圖1 電鏡下外泌體(×50 000)

圖2 Western blotting檢測外泌體標志物CD63和TSG101

2.2 兩組血清外泌體miRNA- 223的表達水平

宮頸癌組血清外泌體miRNA- 223的相對表達量為2.26±0.68，明顯高于對照組的0.89±0.21，差異有統(tǒng)計學意義(t=23.199，P<0.001)。

2.3 血清外泌體miRNA- 223診斷宮頸癌的臨床價值分析

用ROC曲線分析血清外泌體miRNA- 223診斷宮頸癌的價值，AUC為0.928(95%CI:0.867～0.976)，最佳截斷值為1.21。miRNA- 223表達量為1.21時，診斷宮頸癌的靈敏度和特異度分別為86.55%和94.37%(圖3)。

圖3 血清外泌體miRNA- 223診斷宮頸癌的ROC曲線

2.4 血清外泌體miRNA- 223表達水平與宮頸癌臨床特征的關系

血清外泌體miRNA- 223表達水平與FIGO分期、淋巴結轉(zhuǎn)移和宮頸浸潤深度有關(P<0.05)，與年齡、腫瘤大小、組織學分級和組織學類型無關(P>0.05)，見表1。

2.5 血清外泌體miRNA- 223表達水平與宮頸癌患者預后的關系

168例宮頸癌患者中位隨訪時間為21個月(3～60個月)。Kaplan- Meier分析結果顯示，高表達組患者OS和DFS均低于低表達組(P<0.001)，見圖4、5。Cox多因素分析結果顯示，F(xiàn)IGO分期Ⅱb～Ⅲa、淋巴結轉(zhuǎn)移、宮頸浸潤深度≥2/3、miRNA- 223高表達是宮頸癌患者OS和DFS的獨立影響因素(P<0.05)，見表2、3。

3 討 論

宮頸癌的發(fā)病率和死亡率均較高，特別是在發(fā)展中國家。我國2012年宮頸癌新發(fā)病例61 691例，預計2030年達到93 500例[12]。早期診斷宮頸癌是臨床上亟須解決的問題。近年來，越來越多的腫瘤標志物被用于輔助診斷宮頸癌并評價患者的預后情況。非編碼RNA是近年來腫瘤領域研究的熱點。miRNA長度為18～25 nt，參與基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用。外泌體中的miRNA具有腫瘤特異性，在不同貯存條件下都較為穩(wěn)定[13]。本研究從血清中分離出外泌體顯示，宮頸癌患者外泌體中miRNA- 223表達水平明顯升高。

miRNA- 223位于X染色體q12上，在多種腫瘤中異常表達。miRNA- 223在不同腫瘤中發(fā)揮的效應也不同。在膀胱癌的研究中，Guo等[7]發(fā)現(xiàn)，miRNA- 223在癌組織中的表達明顯上調(diào)，其可能通過靶向核受體輔活化子1發(fā)揮抑癌作用。Yang等[14]也發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細胞(T47D、MCF- 7、SKB- R3、MDA- MB- 231、MDA- MB- 435)和乳腺組織中miRNA- 223表達下調(diào)，其通過靶向基質(zhì)相互作用分子1抑制癌細胞的增殖和侵襲。但Kurashige等[15]發(fā)現(xiàn)，食管癌組織中miRNA- 223表達水平明顯高于癌旁組織，miRNA- 223可通過調(diào)控含F(xiàn)- 框WD重復域蛋白7發(fā)揮促癌作用，其高水平表達與食管鱗癌患者生存預后差有關。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者血清外泌體miRNA- 223呈高水平表達，并且與患者不良預后有關。Gao等[4]通過生物信息學方法分析得出，宮頸癌組織中miRNA- 223表達水平上調(diào)。

表1 血清外泌體miRNA- 223表達水平與宮頸癌臨床特征的關系例

圖4 宮頸癌患者的總體生存率分析

圖5 宮頸癌患者的無病生存率分析

表2 Cox單因素和多因素分析影響宮頸癌患者OS的因素

表3 Cox單因素和多因素分析影響宮頸癌患者DFS的因素

在體外研究中，Wu等[8]發(fā)現(xiàn)，宮頸癌HeLa細胞的miRNA- 223表達上調(diào)，其可能通過FOXO1基因促進癌細胞增殖。上述研究提示，miRNA- 223在宮頸癌中發(fā)揮促癌作用。

本研究采用ROC曲線法分析了血清外泌體miRNA- 223診斷宮頸癌的臨床價值，結果顯示miRNA- 223診斷宮頸癌的靈敏度和特異度分別為86.55%和94.37%。血清外泌體miRNA在癌癥中的診斷價值既往已有報道。盡管如此，未來還需要開發(fā)出外泌體miRNA快速檢測試劑盒，才能適用于臨床上癌癥的早期篩查和診斷。本研究結果顯示，F(xiàn)IGO分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、宮頸浸潤深度與宮頸癌患者的OS及DFS有關，這與既往報道[16- 17]一致。血清外泌體miRNA- 223高表達是宮頸癌患者OS和DFS的獨立影響因素，這是因為miRNA- 223參與了宮頸癌細胞的增殖和侵襲，進而影響到患者的預后。

本研究的局限性為：(1) 本研究的樣本量相對較小，因此對結果的解釋需要謹慎。(2) 本研究僅檢測了miRNA- 223表達水平的變化，未分析下游靶分子的變化。因此，未來需要開展細胞及動物研究，以進一步明確miRNA- 223的生物學意義。(3) 本研究未檢測宮頸息肉、子宮內(nèi)膜異位癥、宮頸管肌瘤和宮頸乳頭瘤等良性病變患者血清外泌體miRNA- 223的表達水平，miRNA- 223對于宮頸癌鑒別診斷的意義需要未來進一步研究。

綜上所述，宮頸癌患者血清外泌體miRNA- 223的表達水平明顯高于健康人，miRNA- 223對宮頸癌的早期診斷及預后判斷有一定價值。