鄭聲琴,范璟,鄭勤,童金龍,田小強(qiáng)

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院/南京市第二醫(yī)院 1.腫瘤科, 2.中心實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京 210003)

肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，在全球惡性腫瘤發(fā)病率中排名第5位，而其死亡率位于惡性腫瘤死亡率的第4位，且有逐年上升趨勢[1]。放射治療在肝癌局部治療中受到越來越多的重視，相繼被列入各國肝癌的治療指南當(dāng)中，成為近年來腫瘤放療學(xué)者關(guān)注的最新熱點(diǎn)，在肝癌、早期非小細(xì)胞肺癌、椎體轉(zhuǎn)移癌的治療中發(fā)揮顯著的局部控制療效[2]。

腫瘤的免疫治療是近年來最矚目的治療手段。腫瘤免疫治療的研究方向主要是兩個方面：一是在體外對T細(xì)胞進(jìn)行基因修飾再回輸?shù)襟w內(nèi)；二是通過抗體刺激免疫細(xì)胞使其發(fā)揮抗腫瘤作用[3]。本研究將從后者角度出發(fā)，以單次大分割放療后肝癌細(xì)胞釋放的蛋白為抗原負(fù)載樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)，探究其對DC表型、細(xì)胞因子分泌、功能的影響，旨為肝癌的臨床治療提供數(shù)據(jù)支撐。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年8月至2018年8月南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院收治的5例肝癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：通過病理學(xué)、CT和MRI檢測，確診為原發(fā)性肝癌的患者；患者無其他重要臟器重大疾病；患者簽訂本研究的知情同意書。采集患者外周血5 ml，用于后續(xù)研究。

1.2 主要試劑

RPMI- 1640和DMEM培養(yǎng)基均購自Gibco公司；淋巴細(xì)胞分離液購自南京三生生物技術(shù)有限公司；磁珠分選試劑盒購自美天旎公司；細(xì)胞因子IL- 4、GM- CSF和TNF- α購自PeproTech公司；流式抗體均購自eBioscience公司；ELISA試劑盒購和MTT試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；胞內(nèi)染色試劑盒購自BD公司。

1.3 DC的體外培養(yǎng)

利用Ficoll密度梯度離心法分離經(jīng)肝素抗凝的肝癌患者外周血單核細(xì)胞(PBMC)。經(jīng)PBS洗滌后，利用磁珠分選法分選PBMC獲得CD14+單核細(xì)胞，CD14+細(xì)胞>95%。將獲得的單核細(xì)胞以2×106ml-1的濃度接種到RPMI- 1640培養(yǎng)基中，在37 ℃體積分?jǐn)?shù)5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育，并加入細(xì)胞因子GM- CSF(500 U·ml-1)和IL- 4(200 U·ml-1)。每隔3 d對細(xì)胞進(jìn)行半量換液并補(bǔ)充上述細(xì)胞因子。在培養(yǎng)到第5天時，加入促進(jìn)DC成熟因子LPS(100 ng·ml-1)。再經(jīng)48 h培養(yǎng)，即可獲得成熟DC細(xì)胞。

1.4 DC表面表型的流式細(xì)胞儀測定

分別收集上述培養(yǎng)到第5天和第7天的非成熟和成熟DC，經(jīng)PBS洗滌后，轉(zhuǎn)入流式管中，分別加入PerCP、PE、FITC或APC標(biāo)記的抗人HLA- DR、CD40、CD80、CD83、CD86抗體，置4 ℃避光孵育30 min后，用PBS洗滌2次，加入250 μl PBS懸浮細(xì)胞，最后利用流式細(xì)胞儀檢測分析DC表型。

1.5 肝癌腫瘤相關(guān)抗原的制備

用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基對肝癌細(xì)胞HepG2進(jìn)行培養(yǎng)，將HepG2細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為1×106ml-1，接種到25 cm2培養(yǎng)瓶中，在37 ℃體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。待HepG2細(xì)胞鋪滿瓶底時，進(jìn)行放療照射。將培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞分為兩組，即一組照射劑量為15Gy/1f，另一組照射劑量為5Gy/3f。照射完成后，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞上清，以1 600 r·min-1離心5 min后，繼續(xù)收集上清，重復(fù)上述步驟1次。將獲得的上清以10 000 r·min-1離心20 min，取獲得的沉淀作為HepG2細(xì)胞釋放的腫瘤相關(guān)抗原(tumor- associated antigen, TAA)，用PBS溶解后存貯于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 ELISA

將上述培養(yǎng)的成熟DC分為3組：一組加入25 μg·ml-115 Gy/1f TAA進(jìn)行刺激(以下稱為15 Gy/1f組);一組加入25 μg·ml-15 Gy/3f TAA(以下稱為5 Gy/3f組)；一組作為陰性對照。在37 ℃體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h，以1 600 r·min-1離心5 min，取細(xì)胞培養(yǎng)上清。利用ELISA試劑盒檢測DC分泌細(xì)胞因子IL- 12p70、IL- 1β、IL- 6、IL- 18的情況。

1.7 免疫磁珠法(MACS)分離純化T淋巴細(xì)胞

取上述提取的肝癌患者外周血PBMC，用PBS洗滌細(xì)胞，以1 600 r·min-1離心5 min，取沉淀的細(xì)胞，加入80 μl PBS重懸細(xì)胞，加入20 μl CD3磁珠，置4 ℃ 孵育30 min；用PBS洗滌細(xì)胞，以1 600 r·min-1離心5 min，取500 μl PBS重懸細(xì)胞。將LS分離柱放置在MACS分離器磁場中，用1 ml PBS沖洗分離柱，重復(fù)操作3次。收集流出液，流出液中含有T淋巴細(xì)胞。

1.8 DC與T細(xì)胞的共培養(yǎng)

根據(jù)上述方法將DC分為3組，分別為15 Gy/1f TAA+DC組、5 Gy/3f TAA+DC組和僅DC組。將DC細(xì)胞濃度調(diào)整到1×104ml-1，接種到24孔板中，DC∶T細(xì)胞以1∶10的比例接種上述分選的T淋巴細(xì)胞，并以僅加入T細(xì)胞組作為陰性對照。在37 ℃體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)7 d。通過胞內(nèi)染色法，利用流式細(xì)胞儀分別檢測CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞分泌IFN- γ情況。

1.9 MTT法測定活化T細(xì)胞的殺傷活性

取上述DC和T細(xì)胞共培養(yǎng)7 d后的細(xì)胞，制備成5×105ml-1的單細(xì)胞懸液，加入含有HepG2細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(20∶1)，作為實(shí)驗(yàn)組。另外單獨(dú)加入未經(jīng)DC激活的T細(xì)胞作為對照組，每孔均設(shè)3個復(fù)孔。放置在37 ℃體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，以1 600 r·min-1離心5 min，棄去上清，每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg·ml-1)，繼續(xù)孵育4 h，離心去上清，每孔加入100 μl二甲亞砜，振蕩后溶解15 min。利用酶標(biāo)儀在570 nm處測定OD值。T細(xì)胞殺傷活性(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD570 nm-對照組OD570 nm)/HepG2 OD570 nm×100%。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 肝癌患者外周血體外DC的培養(yǎng)及鑒定

利用細(xì)胞因子IL- 4和GM- CSF刺激肝癌患者PBMC，在培養(yǎng)第5天收獲非成熟DC。在15Gy條件下對肝癌細(xì)胞HepG2進(jìn)行照射，通過反復(fù)離心法獲得15Gy/1f TAA。利用流式細(xì)胞儀檢測非成熟DC和負(fù)載了15Gy/1f TAA的DC細(xì)胞表面HLA- DR、CD40、CD80、CD83、CD86分子的表達(dá)情況。由圖1和圖2結(jié)果可知，負(fù)載TAA的DC[15Gy/1f TAA +非成熟DC(iDC)]細(xì)胞表面HLA- DR、CD40、CD80、CD83、CD86分子表達(dá)的百分比和平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)均高于iDC：(1) HLA- DR百分比，(90.48±3.09)%vs(68.08±6.29)%，P=0.009 5；CD40百分比，(50.23 ±8.81)%vs(8.43±1.29)%，P=0.017 9；CD80百分比，(36.38±8.06)%vs(2.44±0.99)%，P=0.026 9；CD83百分比，(45.50±13.55)%vs(2.48±0.95)%，P=0.045 4；CD86百分比，(56.75±10.8)%vs(21.43±3.55)%，P=0.029 2。(2) HLA- DR的MFI，3 478 ±494.3vs682.5±97.45，P=0.007 5；CD40的MFI，876.3±53.38vs280±17.76，P<0.001；CD80的MFI，331±44.27vs130±11.02，P=0.016；CD83的MFI，265.8 ±39.42vs87.33±12.03，P=0.033 7；CD86的MFI，18 189±428.7vs3 020±477.1，P=0.044 3。

2.2 單次大分割放療后HepG2細(xì)胞釋放的TAA對DC細(xì)胞因子分泌的影響

在成熟DC中分別加入15Gy/1f和5Gy/3f條件下的TAA。通過ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中DC分泌的細(xì)胞因子濃度。負(fù)載了TAA的DC分泌細(xì)胞因子IL- 12p70、IL- 1β、IL- 6、TNF- α的濃度均高于未加TAA的DC組。其中15Gy/1f組(15Gy/1f TAA+DC)的DC分泌細(xì)胞因子IL- 12p70和IL- 18的濃度高于5Gy/3f組(5Gy/3f TAA+DC)。15Gy/1f TAA+DC組、5Gy/3f TAA+DC組和DC組各細(xì)胞因子分泌比較:IL- 12p70的質(zhì)量濃度,(996.6±118.0)pg·ml-1vs(564.4±54.04)pg·mlvs(327.2±30.63) pg·ml-1，P=0.000 2；IL- 1β的質(zhì)量濃度，(196.2±31.32)pg·ml-1vs(187.4±22.14)pg·ml-1vs(86.40±8.19)pg·ml-1，P=0.008 6；IL- 6的質(zhì)量濃度，(2 215±192.8) pg·ml-1vs(1 395±122.9)pg·ml-1vs(887±51.12) pg·ml-1，P=0.000 1；TNF- α的質(zhì)量濃度，(1 099±109.4)pg·ml-1vs(1 023±81.06)pg·ml-1vs(571.2±66.68)pg·ml-1，P=0.002 2。見圖3。

灰色曲線代表同型對照，深灰色曲線代表DC，黑色曲線代表15Gy/1f TAA+iDC

2.3 負(fù)載TAA的DC刺激特異性T細(xì)胞分泌IFN- γ情況

分別用15Gy/1f組和5Gy/3f組的TAA負(fù)載DC，然后與自體T細(xì)胞共培養(yǎng)，利用流式細(xì)胞儀分別檢測特異性CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞分泌IFN- γ的情況。負(fù)載15Gy/1f TAA的DC刺激特異性CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞分泌IFN- γ均高于5Gy/3f組 (P<0.05)，見表1。

表1 不同抗原負(fù)載DC刺激特異性T細(xì)胞分泌IFN- γ情況

2.4 活化后T細(xì)胞的殺傷活性

15Gy/1f組刺激的T細(xì)胞殺傷活性最高，達(dá)到(38.33±1.76)%，顯著高于5Gy/3f組的(29.33±2.19)%(P<0.05)，見圖4。

3 討 論

原發(fā)性肝癌是起源于肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤。2018年我國肝癌發(fā)病率、死亡率和1年患病率分別為18.3/10萬、17.1/10萬和10.8/10萬[4]。原發(fā)性肝癌具有發(fā)病迅速、致死率高、生存期短等特點(diǎn)，這嚴(yán)重影響了我們?nèi)嗣竦纳】?，因此尋求切?shí)有效的臨床治療方法迫在眉睫。

放療在肝癌的局部治療中越來越受重視，特別是單次大分割放療也有應(yīng)用到臨床的實(shí)例[5- 6]。放療一方面可以提高腫瘤細(xì)胞上主要組織相容性復(fù)合物- I(MHC- 1)的表達(dá)，這有利于提高細(xì)胞毒性T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別[7]；另一方面也可以提高腫瘤死亡受體(如Fas等)的表達(dá)，這有利于免疫細(xì)胞通過Fas配體與腫瘤細(xì)胞Fas受體的結(jié)合傳遞信號，引起靶細(xì)胞凋亡[8]。但單次大分割放療對免疫細(xì)胞功能影響的研究較少。DC是人體內(nèi)最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞(antigen- presenting cells, APC)，能攝取、加工、處理抗原從而啟動激活T細(xì)胞，在腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。因此，本研究將在體外模擬體內(nèi)環(huán)境，探討單次大分割放療對DC細(xì)胞表型、細(xì)胞因子分泌及T細(xì)胞功能的影響。

圖2 體外培養(yǎng)DC細(xì)胞表面分子表達(dá)的百分比和MFI值(n=4)

首先，本研究利用單次大分割放療(15Gy)照射肝癌細(xì)胞HepG2。利用反復(fù)離心法獲得TAA，通過流式細(xì)胞儀檢測負(fù)載了15Gy/1f TAA的DC細(xì)胞表面分子的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，通過15Gy照射腫瘤細(xì)胞釋放的抗原可以促進(jìn)DC細(xì)胞表面分子HLA- DR、CD40、CD80、CD83和CD86表達(dá)的提高。HLA- DR是DC激活CD4+T細(xì)胞的關(guān)鍵分子，CD40、CD80和CD86與DC刺激T細(xì)胞抗原提呈能力有關(guān)，而CD83是DC成熟的標(biāo)志[9]。這些分子的表達(dá)都有利于DC發(fā)揮免疫刺激作用，說明經(jīng)過單次大分割放療后肝癌細(xì)胞釋放的TAA有利于DC的成熟，這一功能與促進(jìn)DC成熟的細(xì)胞因子TNF- α、LPS及CD40L等類似[10- 11]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，通過ELISA法檢測了15Gy/1f TAA對DC細(xì)胞因子分泌的影響。結(jié)果提示，經(jīng)過抗原刺激后，DC分泌細(xì)胞因子IL- 12p70、IL- 1β、IL- 6、IL- 18均高于未刺激組。同時，以5Gy/3f TAA為對照組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高劑量放療組更能刺激DC分泌細(xì)胞因子。因此，單次大分割放療更有利于DC對免疫細(xì)胞的激活。這一結(jié)果與Kulzer等[12]的研究結(jié)果一致。

TAA負(fù)載DC15Gy/1f組相比5Gy/3f組更能刺激CD4+和CD8+T細(xì)胞分泌IFN- γ。這一研究結(jié)果在小鼠體內(nèi)也有一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Gupta等[13]在小鼠中發(fā)現(xiàn)，單次大分割放療(10 Gy)可以通過DC激活腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤免疫作用。最后，被激活的T細(xì)胞對肝癌細(xì)胞HepG2具有殺傷作用，而且相比5Gy/3f組，15Gy/1f組對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用更強(qiáng)。

圖3 負(fù)載TAA的DC分泌細(xì)胞因子情況

圖4 不同抗原負(fù)載DC激活的T細(xì)胞對HepG2細(xì)胞的殺傷活性

綜上所述，單次大分割放療更能刺激DC發(fā)揮免疫激活作用，可促進(jìn)DC的成熟、細(xì)胞因子分泌及激活T細(xì)胞特異性殺傷腫瘤細(xì)胞。