汪東昇，鄭斯莉，程明和，繆朝玉 （海軍軍醫(yī)大學(xué)藥理學(xué)教研室，上海 200433）

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）是一種經(jīng)典輔酶，對(duì)線粒體電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)至關(guān)重要，在許多生物學(xué)功能中起著關(guān)鍵作用[1]。煙酰胺單核苷酸（NMN）是NAD 生物合成的關(guān)鍵中間體。NMN 在心腦血管疾病、肝腎功能、血管和內(nèi)皮功能，以及免疫和炎癥、衰老等各類疾病治療方面都具有相當(dāng)強(qiáng)的潛力[2]，常被人稱為“萬能藥”。NMN 能夠通過口服、靜脈注射、腹腔注射（小鼠）等多種給藥途徑進(jìn)入體內(nèi)，通常具有較高的安全性。在急性毒性實(shí)驗(yàn)中，小鼠連續(xù)7 d 給予最大灌胃劑量和飽和濃度的NMN，每天1 次，耐受性良好，除血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶略有升高外，其余生物標(biāo)志物基本保持不變，而相同處理?xiàng)l件下的比格犬，會(huì)有輕度的肌酐和尿酸升高[3]；在長期給藥實(shí)驗(yàn)中，小鼠連續(xù)12 個(gè)月給予100 和300 mg/kg 的NMN，均未出現(xiàn)不良反應(yīng)[4]。在出血性休克治療方面，對(duì)出血性休克大鼠模型，術(shù)前連續(xù)5 d 的NMN 飲水給藥和術(shù)后靜脈推注NMN 均能縮短休克復(fù)蘇時(shí)間和提高復(fù)蘇后的存活率[5]。據(jù)報(bào)道[6-9]，在炎癥治療方面，NMN 及相關(guān)代謝產(chǎn)物煙酰胺核糖、煙酰胺都具有一定抗炎作用。

內(nèi)毒素休克是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，會(huì)導(dǎo)致各系統(tǒng)衰竭，包括循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、血液系統(tǒng)，損害肝臟和腎臟功能[10]。相關(guān)研究顯示，最佳的治療時(shí)間在發(fā)病6 h 內(nèi)，能夠提高患者的生存率，降低病死率[11]。目前臨床內(nèi)毒素休克以藥物治療為主（如血管活性藥物、激素、抗菌素等）[12]，同時(shí)輔以液體復(fù)蘇、腦神經(jīng)保護(hù)、吸氧等常規(guī)治療。為便于對(duì)內(nèi)毒素休克開展研究治療，通常使用LPS 進(jìn)行內(nèi)毒素休克動(dòng)物造模，LPS 是G-菌細(xì)胞壁外膜上的主要成分，也叫內(nèi)毒素，能引起嚴(yán)重的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，是G-菌的主要致病成分之一[13]。

目前，NMN 對(duì)內(nèi)毒素休克的治療作用尚未知。本研究旨在探究NMN 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的內(nèi)毒素休克小鼠模型的死亡率影響，為闡明NMN 在內(nèi)毒素休克治療方面的作用提供線索。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器

煙酰胺單核苷酸[NMN，純度≥95%，?25～?15 ℃保存，邦泰生物工程（深圳）有限公司]；煙酰胺單核苷酸[NMN～，純度≥95%，2～8 ℃保存，尚科生物醫(yī)藥（上海）有限公司]；脂多糖（LPS，美國Sigma 公司）；BT25S 精密電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；獨(dú)立通風(fēng)系統(tǒng)（上海鳴勵(lì)實(shí)驗(yàn)室科技發(fā)展有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)8 周齡雄性C57BL/6J 小鼠(西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)。實(shí)驗(yàn)前在相對(duì)潔凈的環(huán)境下使用獨(dú)立通風(fēng)系統(tǒng)，將動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)2 周。期間動(dòng)物自由飲水、進(jìn)食?；\具內(nèi)溫度22～26 ℃、濕度40%～70%，籠內(nèi)維持正壓20～25 Pa，每小時(shí)換氣次數(shù)60～70 次，室內(nèi)明暗交替12 h（8:00～20:00 照明）。

1.3 動(dòng)物分組、模型制備與給藥處理

根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康模瑢57BL/6J 小鼠隨機(jī)分為給藥組和對(duì)照組。腹腔注射LPS（10 mg/kg）進(jìn)行內(nèi)毒素休克造模，在造模前或者造模后進(jìn)行NMN 腹腔注射給藥，給藥方式分為單次給藥和兩次給藥方式。具體分成5 個(gè)實(shí)驗(yàn)：①造模后0.5 h給藥，劑量為10、30、100、300 mg/kg；②造模前0.5 h給藥，劑量為30、100、300、600 mg/kg；③造模后0.5 h 和12 h 兩次給藥，每次300 mg/kg；④造模后0.5 h 和12 h 分別用2 種不同廠家的NMN 給藥，劑量為300 mg/kg；⑤造模前0.5 h 用不同廠家的NMN 給藥，劑量為300 mg/kg。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

使用Log-rank 檢驗(yàn)，對(duì)給藥組和溶劑對(duì)照組的生存曲線進(jìn)行比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，使用GraphPad Prism8 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 LPS 造模后0.5 h 單次給予NMN 無明顯治療作用

如圖1 所示，LPS 造模后0.5 h 給予300 mg/kg NMN 組小鼠首次出現(xiàn)死亡的時(shí)間比生理鹽水組更早，整個(gè)觀察期間給藥組小鼠死亡的總體趨勢(shì)要稍快于生理鹽水組，且在觀察末期存活的動(dòng)物數(shù)量略少。但兩組生存曲線之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.216 1）。因此，LPS 造模后0.5 h 給予300 mg/kg NMN 不具有治療內(nèi)毒素休克的作用，甚至有輕微增加內(nèi)毒素休克死亡率的趨勢(shì)。

圖1 LPS 造模后300 mg/kg NMN 單次給藥對(duì)內(nèi)毒素休克小鼠生存時(shí)間的影響（n=10）

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了LPS 造模后0.5 h 給予多個(gè)不同劑量NMN 對(duì)內(nèi)毒素休克死亡率的影響，如圖2所示，與生理鹽水組相比，10、30、100、300 mg/kg NMN 給藥組的小鼠首次出現(xiàn)死亡的時(shí)間均接近，各組中位生存時(shí)間：300、100、30、10 mg/kg 給藥組分別為51、55、41 和38 h，生理鹽水組為37 h。整個(gè)觀察期間NMN 給藥各組死亡速度較生理鹽水組稍緩，其中放緩趨勢(shì)最明顯的是100 mg/kg 劑量組，但均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.433 4），表明小鼠在LPS 造模后0.5 h 單次給予NMN 不能改善內(nèi)毒素休克死亡率或減緩死亡速度。

2.2 LPS 造模前0.5 h 單次給予NMN 無明顯治療作用

圖2 LPS 造模后不同劑量NMN 單次給藥對(duì)內(nèi)毒素休克小鼠生存時(shí)間的影響（n=14）

在LPS 造模前0.5 h 進(jìn)行NMN 給藥。如圖3所示，300 mg/kg NMN 預(yù)防給藥組小鼠首次出現(xiàn)死亡的時(shí)間稍早于生理鹽水組，而2 組死亡的總體趨勢(shì)相近，前者的中位生存時(shí)間為83 h，后者為91 h，生存曲線比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.594 6），故LPS造模前0.5 h 給予300 mg/kg NMN 不能改善內(nèi)毒素休克小鼠的死亡率，不具有防治作用。

圖3 LPS 造模前300 mg/kg NMN 單次給藥對(duì)內(nèi)毒素休克小鼠生存時(shí)間的影響

隨后又進(jìn)行多個(gè)不同劑量NMN 單次預(yù)給藥實(shí)驗(yàn)。如圖4 所示，NMN 30、100、300、600 mg/kg組與生理鹽水組小鼠首次出現(xiàn)死亡的時(shí)間均相近，之后各組死亡趨勢(shì)也類似，各組中位生存時(shí)間分別是：NMN 給藥組30 mg/kg 為34 h、100 mg/kg 為43 h、300 mg/kg 為40 h、600 mg/kg 為55 h，生理鹽水組為37 h，各組生存曲線也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，在造模前進(jìn)行NMN 單次預(yù)給藥對(duì)于LPS 構(gòu)建的內(nèi)毒素休克模型無明顯改善生存率的作用。

圖4 LPS 造模前不同劑量NMN 單次給藥對(duì)內(nèi)毒素休克小鼠生存時(shí)間的影響（n=15）

2.3 LPS 造模后0.5 h 和12 h 兩次給予NMN 增加內(nèi)毒素休克死亡率

考慮到NMN 在體內(nèi)的代謝速度較快，能夠迅速入血進(jìn)入各個(gè)組織器官并代謝為活性分子NAD，而NAD 被證明在多種炎癥性疾病中具有保護(hù)作用，因此，觀察NMN 的2 次給藥是否對(duì)內(nèi)毒素休克有治療效果。

如圖5 所示，2 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，LPS 造模后0.5 h 和12 h，給予2 次NMN（每次300 mg/kg）治療組小鼠其首次出現(xiàn)死亡的時(shí)間早于生理鹽水組；之后，NMN 治療組小鼠死亡速度明顯快于對(duì)照組，且觀察末期NMN 治療組小鼠存活率不及對(duì)照組一半，2 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的生存曲線間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.040 4；P=0.003 8）。因此，該結(jié)果表明，LPS 造模后2 次NMN 給藥明顯增加小鼠內(nèi)毒素休克死亡率。

2.4 不同廠家NMN 對(duì)LPS 引起的內(nèi)毒素休克的作用基本相同

圖5 LPS 造模后兩次NMN 給藥對(duì)內(nèi)毒素休克小鼠生存時(shí)間的影響（n=10）

不同廠家生產(chǎn)的NMN 因藥物純度、雜質(zhì)成分不同等，可能導(dǎo)致治療效果有差別。為排除非藥物分子本身因素如廠家生產(chǎn)工藝因素，進(jìn)一步明確上述NMN 治療內(nèi)毒素休克的作用，接著引入另一廠家生產(chǎn)的NMN（以下均簡稱NMN～），并同時(shí)測(cè)試比較兩家NMN 產(chǎn)品治療內(nèi)毒素休克的效果。

實(shí)驗(yàn)首先對(duì)LPS 造模后0.5 h 和12 h 的2 次給予NMN（每次300 mg/kg）增加內(nèi)毒素休克死亡率的作用進(jìn)行了驗(yàn)證。如圖6 所示，NMN 給藥組和NMN～給藥組這2 組小鼠首次出現(xiàn)死亡的時(shí)間和觀察末期小鼠存活數(shù)都接近，整個(gè)觀察期小鼠死亡趨勢(shì)非常相似，與生理鹽水對(duì)照組相比，兩組都明顯加重內(nèi)毒素休克小鼠的死亡率，與對(duì)照組的生存曲線間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.049 9；P=0.026 0）。3 組中位生存時(shí)間分別是：NMN 給藥組57.5 h、NMN～給藥組51.5 h、生理鹽水組106.5 h。此外，該結(jié)果與上述單個(gè)NMN 產(chǎn)品連續(xù)2 次給藥效果類似（圖5）。因此，兩家NMN 產(chǎn)品效果基本相同，也進(jìn)一步證明了LPS 造模后0.5 h 和12 h 的2 次給予NMN（每次300 mg/kg）確實(shí)可加重內(nèi)毒素休克病情，加速小鼠的死亡。

圖6 不同廠家NMN 兩次給藥對(duì)內(nèi)毒素休克小鼠生存時(shí)間的影響(n=14)*P＜0.05，與生理鹽水組比較。

最后，實(shí)驗(yàn)又考察了兩家NMN 產(chǎn)品預(yù)防給藥效果，即在LPS 造模前0.5 h 進(jìn)行NMN 或NMN～給藥。如圖7 所示，NMN 組、NMN～組、生理鹽水組3 組小鼠首次出現(xiàn)死亡的時(shí)間及之后每組小鼠死亡的速度都相近，直至每組均剩20%小鼠存活（第71 小時(shí)）。之后，生理鹽水組小鼠不再死亡，而NMN 組、NMN～組小鼠陸續(xù)死亡殆盡。3 組中位生存時(shí)間分別是：NMN 給藥組40 h、NMN～給藥組45 h、生理鹽水組37 h?？梢?，兩家NMN 產(chǎn)品作用相似，對(duì)LPS 所致的內(nèi)毒素休克無治療效果，且與生理鹽水組比較時(shí)均有加重內(nèi)毒素休克死亡率的趨勢(shì)，但是均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.644 7；P=0.972 5）。該結(jié)果與上述NMN 單次預(yù)防給藥的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致(圖3 和圖4)。

圖7 不同廠家NMN 預(yù)防給藥對(duì)內(nèi)毒素休克小鼠生存時(shí)間的影響(n=15)

3 討論和總結(jié)

目前NMN 是保健品領(lǐng)域的開發(fā)熱點(diǎn)，以抗衰老以及各類疾病治療作用為目的，在國內(nèi)外已有不少人開始服用NMN[14]。但是NMN 對(duì)內(nèi)毒素休克的作用尚未知，對(duì)患有這種疾病的患者能否服用NMN 亦不清楚。

根據(jù)現(xiàn)有的研究報(bào)道，NMN 在小鼠疾病模型其腹腔注射給藥的有效劑量為10～600 mg/kg[2,4]。本實(shí)驗(yàn)中，我們測(cè)試了不同NMN 劑量尤其是300 mg/kg 時(shí)對(duì)小鼠內(nèi)毒素休克的治療效果，結(jié)果顯示，小鼠在LPS 造模后0.5 h 或造模前0.5 h 單次給予不同劑量NMN 均無明顯改善生存率的作用，不具有治療效果；甚至在LPS 造模后兩次NMN 給藥明顯增加小鼠內(nèi)毒素休克死亡率。為排除廠家生產(chǎn)工藝等因素，我們又同時(shí)用兩個(gè)廠家生產(chǎn)的NMN 產(chǎn)品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以重復(fù)上述結(jié)果，最終再次證明LPS 造模后兩次給予NMN 確實(shí)可加速小鼠的死亡，增加死亡率。

因此，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NMN 在某些疾病尚未證明其安全性的情況下，應(yīng)謹(jǐn)慎推廣，尤其是內(nèi)毒素休克的患者，應(yīng)慎用甚至是禁用NMN 治療。