袁一凡，陸 峰 （海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，上海 200433）

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）是指供體熒光分子發(fā)射光譜與受體分子的吸收光譜有顯著的重疊且分子間距小于10 nm 時(shí)發(fā)生的一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移[1]，導(dǎo)致供體熒光淬滅而受體熒光增強(qiáng)或不變。近些年，F(xiàn)RET 技術(shù)以其精準(zhǔn)高效的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用在分析檢測(cè)領(lǐng)域，為檢測(cè)生物分子提供了重要的分析方法。基于FRET 技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞內(nèi)ATP 分子的檢測(cè)[2]，金屬離子如汞離子的檢測(cè)[3-4]，許多疾病相關(guān)基因[5-6]以及酶活性的檢測(cè)等[7-8]。

銀納米簇（AgNCs），作為一種新型的低毒性“綠色”熒光標(biāo)記材料，具有量子產(chǎn)率高、毒性低、生物相容性好等特點(diǎn)[9]，使得其被廣泛應(yīng)用在多個(gè)研究領(lǐng)域。在銀納米簇的合成過(guò)程中，相較于其他的合成模板，DNA 更具優(yōu)勢(shì)，如DNA 具有分子識(shí)別的功能（包括對(duì)于互補(bǔ)鏈和小分子的識(shí)別），不同序列的DNA 模板可調(diào)諧不同的發(fā)射波長(zhǎng)等[10]。

研究發(fā)現(xiàn)，G 堿基可以增強(qiáng)DNA/銀納米簇（DNA/AgNCs）的熒光強(qiáng)度[11-12]，基于此，我們?cè)O(shè)計(jì)了系列非銀簇模板部分的互補(bǔ)鏈，考察G 堿基個(gè)數(shù)對(duì)于銀簇?zé)晒鈴?qiáng)度的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，暴露的G 堿基個(gè)數(shù)與銀簇的熒光強(qiáng)度呈正相關(guān)關(guān)系。該實(shí)驗(yàn)不僅驗(yàn)證了G 堿基對(duì)于銀簇?zé)晒獾脑鰪?qiáng)作用，還提示我們?cè)谠O(shè)計(jì)含有G-四聯(lián)體適配體的熒光探針時(shí)，可通過(guò)改變非銀簇部分的互補(bǔ)鏈長(zhǎng)短來(lái)調(diào)控?zé)晒獾拇銣缂盎謴?fù)程度，以獲得最佳的檢測(cè)效果。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

VS-100C 恒溫混勻儀（無(wú)錫沃信儀器制造有限公司）；FL-6500 熒光分光光度計(jì)（PerkinElmer）；ZEN3600 粒徑電位測(cè)定儀（英國(guó)馬爾文公司）；精密電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；Vortex-Genie2 多功能旋渦混合器（美國(guó)Scientific Industries 公司）；TGL-16C 離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì) FE20[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；Tecnai G2 F30 高分辨率電子顯微鏡（荷蘭FEI 公司）

1.2 試劑

硝酸銀、硼氫化鈉、鹽酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；三羥甲基氨基甲烷(Tris，大連美侖生物技術(shù)有限公司)；氯化鎂、氯化鈉、氯化鉀(上海泰坦科技股份有限公司)；試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏蒸餾水。

相關(guān)DNA 序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。合成DNA-AgNCs 的模板序列及P1A5C5 的互補(bǔ)序列如表1、表2 所示。

表1 DNA/AgNCs 的模板序列

表2 P1A5C5 的互補(bǔ)序列

2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

2.1 DNA 溶液的配制及處理

加入相應(yīng)體積的20 mmol/L Tris-HCl（pH=7.4）緩沖溶液將DNA 溶解，即制得100μmol/L DNA 溶液，將制得的DNA 溶液95 ℃加熱5 min 后，冰水浴冷卻10 min。

2.2 銀納米簇的制備

參考文獻(xiàn)中的合成方法[13]，將一定體積的硝酸銀溶液加入到上述DNA 溶液中（20 mmol/L Tris-HCl，pH=7.4），充分震蕩混勻，25 ℃孵育20 min，靜置，將一定體積新配制的硼氫化鈉引入到上述反應(yīng)混合物中，最終使得體系中DNA、硝酸銀、硼氫化鈉的濃度分別為5、30、30μmol/L（即DNA：Ag+∶NaBH4的摩爾比為1∶6∶6），劇烈震蕩混勻，室溫下避光反應(yīng)3 h 后，4 ℃避光反應(yīng)過(guò)夜。得到的銀納米簇溶液在4 ℃保存以備用。

2.3 銀納米簇的表征

熒光圖譜表征：將2μmol/L 的銀納米簇溶液在200～800 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行熒光光譜預(yù)掃描，設(shè)置激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為10 nm，掃描速度為1 200 nm/min，電壓值為400 V。

高分辨率透射電子顯微鏡表征：將銀納米簇溶液滴加銅網(wǎng)后觀察。

2.4 熒光光譜測(cè)量

在含有100 mmol/L NaCl,2 mmol/L MgCl2，5 mmol/L KCl 的20 mmol/L Tris-HCl 緩沖溶液中（pH=7.4），加入銀簇溶液（2μmol/L），將互補(bǔ)的DNA 溶液（表2）以1∶1 的摩爾比分別加入到上述體系溶液中，充分震蕩混勻，37 ℃孵育20 min。在室溫條件下進(jìn)行熒光光譜測(cè)量。激發(fā)波長(zhǎng)為486 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為10 nm，掃描速度為1 200 nm/min，電壓值為400 V。

3 結(jié)果與討論

3.1 銀納米簇的合成與表征

在進(jìn)行DNA/AgNCs 的合成時(shí)，基于胞嘧啶堿基與銀離子的作用，一般選擇富含胞嘧啶堿基的序列作為合成模板，筆者根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的模板序列結(jié)合模板優(yōu)化設(shè)計(jì)[13-16]，選擇了5 種銀簇模板并進(jìn)行了相應(yīng)的堿基優(yōu)化設(shè)計(jì)，如表1 所示，結(jié)果顯示P1A5C5 的熒光信號(hào)強(qiáng)度較高（如圖1），且4 ℃避光保存45 d 后，熒光信號(hào)強(qiáng)度基本不變，穩(wěn)定性良好。因此，我們使用該序列合成的DNA/AgNCs 進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

對(duì)生成的P1A5C5 銀納米簇體系進(jìn)行熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的表征，結(jié)果如圖2 所示，在487 nm 激發(fā)條件下，發(fā)射波長(zhǎng)為577 nm。

DNA/AgNCs 的高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）圖片如圖3 所示，從圖中可以看出，DNA/AgNCs 的直徑約為2～3 nm,分散性良好。

圖1 5 種DNA/AgNCs 模板序列的熒光圖譜表征

圖2 P1 A5 C5 銀納米簇的熒光圖譜表征

圖3 DNA/AgNCs 的高分辨率透射電子顯微鏡圖

圖4 P1 A5 C5 與互補(bǔ)鏈作用后的熒光光譜圖及線性關(guān)系圖

3.2 互補(bǔ)DNA 的設(shè)計(jì)及熒光響應(yīng)情況

在銀簇P1A5C5 序列5′-GGAGGTGGTGGGG AAAAACCCCCTAATTCCCCC-3′中，CCCCCTAA TTCCCCC 為成簇模板序列，下劃線部分為巖沙海葵毒素的G-四聯(lián)體適配體[17]?；贕 堿基對(duì)銀簇的熒光信號(hào)強(qiáng)度有增強(qiáng)作用這一現(xiàn)象，我們?cè)O(shè)計(jì)了一系列適配體部分的互補(bǔ)序列（表2），通過(guò)C-G 堿基互補(bǔ)，適配體部分暴露的G 堿基個(gè)數(shù)不同，導(dǎo)致與銀納米簇作用的堿基G 數(shù)目不同，進(jìn)而對(duì)銀納米簇的熒光信號(hào)強(qiáng)度產(chǎn)生不同的影響。結(jié)果顯示，隨著暴露的G 堿基個(gè)數(shù)的增加，熒光信號(hào)強(qiáng)度增加（圖4A），對(duì)暴露的G 堿基個(gè)數(shù)與熒光信號(hào)強(qiáng)度關(guān)系進(jìn)行擬合，得到的線性方程為：Y=1 726.1X+8 972.5，r=0.978 9（圖4 B）。該研究證明了G 堿基對(duì)銀簇的熒光具有增強(qiáng)效果，反之，通過(guò)C-G 堿基互補(bǔ)配對(duì)，G 堿基與銀簇的作用位點(diǎn)被占據(jù)，無(wú)法與銀簇作用，難以達(dá)到增強(qiáng)熒光信號(hào)強(qiáng)度的作用。因此，隨著暴露堿基個(gè)數(shù)的減少，熒光強(qiáng)度減弱。基于此，可實(shí)現(xiàn)與G-四聯(lián)體適配體有關(guān)的熒光開(kāi)關(guān)的設(shè)計(jì)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)。

在DNA 序列和銀納米簇進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，結(jié)合互補(bǔ)序列的Tm 值，我們研究了互補(bǔ)鏈間實(shí)現(xiàn)堿基互補(bǔ)配對(duì)所需的溫度和時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于4 ℃，在37 ℃條件下孵育，互補(bǔ)鏈間相互作用較強(qiáng)，容易實(shí)現(xiàn)堿基互補(bǔ)配對(duì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度變化較為明顯；同時(shí)，考察了在37 ℃下作用1 h內(nèi)的熒光變化情況，結(jié)果顯示，熒光變化強(qiáng)度隨時(shí)間未發(fā)生明顯變化，最終選擇20 min 作為孵育時(shí)間。

4 結(jié)論

該實(shí)驗(yàn)利用含有G 四聯(lián)體適配體的DNA 序列合成了熒光銀納米簇，基于G 堿基可以增強(qiáng)銀納米簇的熒光這一現(xiàn)象，并結(jié)合堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，設(shè)計(jì)了8 種G 四聯(lián)體適配體的互補(bǔ)鏈，在互補(bǔ)鏈和適配體部分堿基互補(bǔ)配對(duì)后，熒光信號(hào)強(qiáng)度也產(chǎn)生相應(yīng)的變化。隨著互補(bǔ)鏈長(zhǎng)度的縮短，暴露的G 堿基個(gè)數(shù)增加，熒光信號(hào)增強(qiáng)，且暴露的G 堿基個(gè)數(shù)與熒光信號(hào)強(qiáng)度擬合得到的線性方程為：Y=1 726.1X+8 972.5，r=0.978 9。該實(shí)驗(yàn)不僅證實(shí)了G堿基對(duì)熒光銀納米簇有熒光增強(qiáng)作用，還提示我們?cè)谠O(shè)計(jì)含有G 四聯(lián)體的銀納米簇?zé)晒馓结槙r(shí)，可以通過(guò)互補(bǔ)鏈對(duì)熒光信號(hào)的干擾程度來(lái)調(diào)控?zé)晒獾拈_(kāi)閉，這對(duì)進(jìn)一步擴(kuò)展銀納米簇在熒光分析方法中的應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。