張靜如，華俊杰，韓 凌，朱 敏，魯 瑩 （海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，上海 200433）

針對海訓(xùn)需求，本課題組研制出一款能同時滿足防曬和防水母蟄傷需求的防水型多效防護(hù)乳，對于增強(qiáng)海軍部隊日常海訓(xùn)強(qiáng)度和提高海軍戰(zhàn)斗力具有重要作用和意義。經(jīng)文獻(xiàn)和相關(guān)專利調(diào)查，以及初步藥效學(xué)評價[1-5]，本課題確定以LaCl3·7H2O(500 mmol/L)、 MgCl2·6H2O(25 mmol/L)、 CaCl2(25 mmol/L)的水溶液作為防水母蟄傷成分加入到基質(zhì)處方中。鑭是一種重要的稀土元素，廣泛應(yīng)用與電子、醫(yī)藥、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，有文獻(xiàn)報道[6-9]，鑭離子暴露可能會導(dǎo)致人的健康問題，對閾值效應(yīng)而言，需要進(jìn)行未觀察到有害作用劑量（NOAEL）的測定。防護(hù)乳長期、大量涂抹，而且很可能接觸破損的皮膚，鑭離子（La3+）可能通過經(jīng)皮吸收進(jìn)入人體體循環(huán)，而其在體內(nèi)的毒性或潛在毒性均未明確。此外，迄今為止，未見含鑭乳膏的透皮安全性的報道，所以必須對防護(hù)霜中添加的鑭離子進(jìn)行安全性驗證。

電感耦合等離子體發(fā)射光譜技術(shù)具有分析速度快、線性范圍寬、可多元素同時測定、檢出限低等特性，已被廣泛地應(yīng)用于各類物質(zhì)中無機(jī)元素的分析檢測[10]。本文以鑭元素為檢測對象，結(jié)合微波消解與電感耦合等離子體發(fā)射光譜（ICP-OES）技術(shù)，建立一種體內(nèi)含量分析方法，可為多效防護(hù)乳的質(zhì)量分析和透皮安全性評價提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo Scientific iCAP6000 系列電感耦合等離子體光譜儀，包括RF 發(fā)生器、光譜儀系統(tǒng)和光電轉(zhuǎn)換檢測器、iTEVA 工作站（美國賽默飛世爾公司）；MDS-6G 多通量微波消解/萃取系統(tǒng)（上海新儀微波化學(xué)科技有限公司）；AL-104 電子天平（瑞士梅特勒公司）；VORTEX-6 渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器有限公司）；Barnstead D3750 超級純水儀（美國賽默飛世爾公司）。

1.2 藥品與試劑

硝酸（優(yōu)級純，批號：20190920）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；La 元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度1 000 μg/ml）購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心；水為超純?nèi)ルx子水(≥18.2Ω)；多效防護(hù)乳（批號：82004163）為中試放大樣品。

1.3 實驗動物

SD 大鼠，均為雄性，體重約250 g，昭衍（蘇州）新藥研究中心有限公司提供，許可證號（蘇）2018-0006。

2 方法與結(jié)果

2.1 全血樣品采集

給藥前，盡可能剃掉大鼠背部及兩側(cè)體毛，約5 cm×10 cm，休息觀察24 h。實驗前禁食12 h，自由飲水。實驗前，將大鼠編號，用丙酮輕輕擦去皮脂。然后以0.4 g/cm2的劑量分別將防護(hù)乳均勻涂布在大鼠裸露皮膚表面。分別于給藥前和給藥后1 h 在眼眶靜脈叢取血1ml，置于肝素化的離心管中，于?20 ℃條件下保存。

2.2 儀器工作參數(shù)

iCAP6000 系列電感耦合等離子體光譜儀最佳化后工作條件為：射頻功率1 150 W；采樣深度5 mm；冷卻氣流量12 L/min；輔助氣流量0.5 L/min；泵轉(zhuǎn)速45 r/min。樣品沖洗時間30 s；樣品測定次數(shù)3 次。微波消解儀參數(shù)和檢測程序如表1 所示。

表1 全血樣品微波消解程序

2.3 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確吸取血樣1 ml，置于聚四氟乙烯燒杯中，加入硝酸8 ml，混勻，在電熱板上于120 ℃加熱預(yù)消解20 min，血樣可完全溶解為黃色的消解液；然后，按照表1 程序?qū)悠分糜谖⒉ㄏ鈨x中完全消解。取出樣品置于160 ℃的電熱板上加熱趕去硝酸，消解液呈無色透明或略帶黃色，直到四氟乙烯杯剩余溶液小于1 ml 時，將消解液轉(zhuǎn)移至10 ml 量瓶中，用2%硝酸溶液洗滌容器，洗液合并于量瓶中，用2%硝酸溶液稀釋至刻度，搖勻，得到供試品溶液。未經(jīng)給藥處理的血樣經(jīng)過上述消解程序得到的溶液即為空白基質(zhì)溶液。

2.4 對照品溶液的制備

精密量取La 元素標(biāo)準(zhǔn)溶液1 ml，置10 ml 量瓶中，用2%硝酸溶液稀釋至刻度，得到濃度為100 μg/ml 的儲備液(A)。精密量取儲備液0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5 ml，分別置50 ml 量瓶中，用2%硝酸溶液稀釋至刻度，搖勻，得到濃度分別為0.1、0.2、0.5、1、2、5 μg/ml 的一系列對照品溶液。

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1 專屬性試驗

將空白溶液（2%硝酸溶液）、空白基質(zhì)溶液、對照品溶液和供試品溶液依次注入等離子體光譜儀，檢測并記錄結(jié)果，其圖譜如圖1 所示，結(jié)果表明La 在333.749 nm 處譜線干擾較少，對照品溶液和供試品溶液的峰形較好，空白溶液和空白基質(zhì)溶液在此譜線無響應(yīng)，方法的專屬性較好。

圖1 鑭的專屬性圖譜

2.5.2 線性與定量限

將“2.4”項下制備的對照品溶液依次注入ICPOES，檢測并記錄結(jié)果。結(jié)果表明，在0.1～5 μg/ml濃度范圍內(nèi)，儀器響應(yīng)值與濃度呈良好線性關(guān)系，La 的線性方程為Y=33 730X-774.4，r=0.999 8。

將2%硝酸溶液注入ICP-OES 進(jìn)行測試，連續(xù)進(jìn)樣11 次，以空白溶液響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差的3.3 倍計算檢出限，以空白溶液響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差的10 倍計算定量限。方法檢出限為0.002 5 μg/ml，定量限為0.007 7 μg/ml。

2.5.3 準(zhǔn)確度

精密量取空白血樣9 份于燒杯中，各1 ml, 分別精密加儲備液0.16、0.2、0.24 ml，低、中、高每個濃度平行配制3 份。隨后按照“2.3”項下樣品的處理方法進(jìn)行制備，即得空白加標(biāo)溶液。將空白基質(zhì)溶液和空白加標(biāo)溶液分別注入儀器，進(jìn)樣分析，結(jié)果見表2。La 的低、中、高濃度的回收率均在94.9%～102.0%之間，表明本法的回收率良好。

表2 空白血樣加標(biāo)回收率試驗結(jié)果

2.5.4 重復(fù)性

取同一批血樣（給藥后1 h 取血樣本）共6 份，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析。結(jié)果La 含量的RSD 為1.01%，表明本法的重復(fù)性良好。

2.6 樣品測定

4 組樣品在1 h 的取血時點(diǎn)所測得的La 的濃度（μg/ml）如表3 所示。

表3 全血樣品在給藥后1 h 測得的鑭濃度（μg/ml，n=4）

3 討論

3.1 鑭的安全性

La 不是人體必需元素，已有研究表明[7,9,11]鑭具有潛在的毒性，包括神經(jīng)行為和認(rèn)知行為功能障礙，可致肝功能下降，對骨、腎、脾臟、免疫系統(tǒng)均具有負(fù)面影響。鑭可從農(nóng)產(chǎn)品通過胃腸道進(jìn)入人體，但是經(jīng)皮吸收進(jìn)入人體體循環(huán)的情況尚未可知，未見有La 的經(jīng)皮安全性評價的報道。本次試驗建立了La 元素的生物樣本體內(nèi)分析方法，為單次涂抹含鑭防護(hù)乳后24 h 的透皮安全性研究提供了新的方法和思路。

3.2 前處理方法的優(yōu)化

全血中無機(jī)元素的分析常通過兩種途徑：一是以TritonX-100 水溶液或去離子水直接稀釋進(jìn)樣測定；二是通過傳統(tǒng)的干灰化法、濕法消解或微波消解法將血樣完全消解后進(jìn)樣測定[12]。由于全血中含有大量蛋白質(zhì)等物質(zhì)，直接稀釋干擾較多，與濕法、干法消解法相比，微波消解具有加熱快、消解完全、消耗試劑少、節(jié)能環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[13]，故本研究選擇微波消解法對全血樣品進(jìn)行處理。常用的消解溶劑有HNO3、HF、H2O2、HClO4等[14]，本實驗采用HNO3，即可將血液樣品消解為近無色的澄清液體（消解完全），避免了H2O2、HClO4等易爆溶劑的使用。

3.3 La 測定方法的建立

本文通過微波消解-ICP-OES 法，建立了生物樣本中La 的測定方法，該方法操作簡單，分析速度快，靈敏度高，準(zhǔn)確度好，為多效防護(hù)乳中La 的含量測定和安全性評價提供依據(jù)。