宋志兵，張 倩，章越凡，邱 彥，李鐵軍 （1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 001；. 海軍軍醫(yī)大學(xué)

藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，上海 200433；3. 上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院，上海 201200；4. 上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院藥劑科，上海200125）

小膠質(zhì)細(xì)胞是參與防御腦缺血再灌注損傷的主要免疫細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)和神經(jīng)發(fā)生中發(fā)揮重要作用。在缺血性中風(fēng)發(fā)生后，小膠質(zhì)細(xì)胞表型往往會發(fā)生改變[1-2]。小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)活化后會極化為促炎M1 型和抗炎M2 型兩種表型[3-4]。抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞能通過減輕炎癥反應(yīng)、清除細(xì)胞碎片和釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子來促進(jìn)大腦的恢復(fù)。然而小膠質(zhì)細(xì)胞除了具有神經(jīng)保護(hù)作用外，還是大腦中促炎細(xì)胞因子的主要產(chǎn)生者。促炎型小膠質(zhì)細(xì)胞能通過啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)釋放大量的炎性細(xì)胞因子引起炎癥反應(yīng)，阻礙大腦恢復(fù)過程[5-6]。

烏帕替尼(upadacitinib)是一種口服的、可逆的JAK 激酶(Janus kinase)抑制劑，對JAK1 有較強的選擇性，已被批準(zhǔn)用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[7-9]，目前臨床研究正在評估幾種免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎等炎癥相關(guān)疾病[10-11]。有報道稱小膠質(zhì)細(xì)胞的極化與JAK/STAT 信號通路有關(guān)[12-13]，卻沒有對于JAK1 選擇性抑制劑烏帕替尼在神經(jīng)系統(tǒng)應(yīng)用方面的報道。本研究通過使用BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞OGD/R 模型，探討烏帕替尼對BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響及其可能的作用機制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

BV2 細(xì)胞和PC12 細(xì)胞均購自中科院上海細(xì)胞庫，培養(yǎng)條件：高糖型DMEM 培養(yǎng)基，含10%胎牛血清(FBS),置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中。

1.2 儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀（Thermo 公司）；水平高速離心機（Eppendorf 公司）；氧糖剝奪（OGD）裝置（Billups-Rothenberg 公司）；實時定量PCR 儀（美國AB7500）；Odyssey 雙色激光成像系統(tǒng)（LICOR 公司）。

1.3 藥物與試劑

烏帕替尼（貨號：AK600704，美國Ark Pharm公司）；噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒（塞維爾生物科技有限公司）；RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；SYBR Green（Thermo Fisher）；IL-1β、IL-6 和TNF-α 的ELISA 試劑盒（美國R&D 公司）；GAPDH、JAK1、p-JAK1、STAT6、p-STAT6 抗體（CST 公司）。

2 方法

2.1 OGD/R 模型的建立

細(xì)胞接種在細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h 待細(xì)胞貼壁后，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)將孔內(nèi)培養(yǎng)基洗凈，更換為無血清無糖的DMEM 培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板置于OGD 裝置中，用混合氣體（95%N2+5%CO2）將裝置中空氣置換出來，培養(yǎng)板連同OGD 裝置一起放入37 ℃培養(yǎng)箱中3～4 h 后取出細(xì)胞，再更換為含血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.2 MTT 法測細(xì)胞生存率

待測細(xì)胞每孔加入MTT 試劑20 μl，37 ℃孵育4 h 后，將孔內(nèi)液體吸盡棄去，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，震蕩1 min 使結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀檢測492 nm 處吸光度值。計算生存率：每孔的吸光度值為該孔實測吸光度值減去空白吸光度值，對照組吸光度均值定為生存率100%，每孔細(xì)胞生存率=（該孔吸光度值/對照組吸光度均值）×100%。

2.3 細(xì)胞劃痕實驗

BV2 細(xì)胞以3×105個/ml 濃度密度接種于六孔板中，待細(xì)胞長滿底部后，用200 μl 的槍頭垂直沿直尺過圓心迅速在底部劃痕，用PBS 清洗3 遍將劃下的細(xì)胞洗凈，加入無血清無糖DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行OGD 缺氧3 h，之后更換為無血清高糖培養(yǎng)基恢復(fù)氧糖繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在恢復(fù)氧糖期間0、6、12、24 h 拍照觀察遷移變化。劃痕圖片經(jīng)Image J軟件處理圈出劃痕區(qū)域面積S，遷移率=（1-S/S0h）×100%。

2.4 ELISA 檢測炎癥因子

收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，在4 ℃、14 000/min 離心10 min，以去除細(xì)胞或細(xì)胞碎屑，吸取澄清的上清培養(yǎng)基做后續(xù)檢測。按酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒（美國R&D 公司）說明書進(jìn)行操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出每個樣品吸光度值對應(yīng)的炎癥因子含量。

2.5 條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)體系的建立

將BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞正常培養(yǎng)或 OGD 4 h/R24 h后的培養(yǎng)上清液(CM)用原培養(yǎng)基稀釋1 倍后分別加入正?；蛘逴GD 4 h 處理的PC12 神經(jīng)細(xì)胞中，復(fù)氧共培養(yǎng)24 h 后采用 MTT 檢測PC12 細(xì)胞的生存率。

2.6 實時PCR 檢測mRNA 水平

棄去培養(yǎng)基，用PBS 漂洗一次，六孔板中每孔加入200 μl 的異硫氰酸胍裂解液(TransZol Up)，反復(fù)吹打使細(xì)胞充分裂解，室溫靜置5 min。按全式金RNA 提取試劑盒操作步驟提取RNA，之后按全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，儲存于-20 ℃用于后續(xù)實驗。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA使用 7 500 型實時 PCR 儀進(jìn)行定量分析，本實驗使用內(nèi)參基因 GAPDH 對模板進(jìn)行均一化處理。對照組、OGD 組和烏帕替尼組基因之間表達(dá)差異通過2?ΔΔCt計算。

2.7 Western blot 檢測蛋白水平

棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS 清洗2 遍，每孔加入50 μl 預(yù)冷的RIPA 裂解液，放冰上裂解5 min，收集裂解液，于4 ℃、14 000 g 離心15 min，收集上清。二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白濃度，用8% SDS-PAGE 膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，于封閉液室溫封閉2 h 后，更換為一抗在4 ℃孵育過夜，用等滲緩沖液(TBST)漂洗5 min（3 次），加入熒光二抗室溫避光孵育1 h，漂洗干凈后用Odyssey 雙色紅外激光掃描成像系統(tǒng)對膜進(jìn)行掃描。圖像條帶通過image J 軟件進(jìn)行分析，計算蛋白表達(dá)量。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)表示。采用單因素方差分析檢驗差異的顯著性，P＜0.05 表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 烏帕替尼對OGD/R 誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞損傷的影響

結(jié)果如圖1 所示，BV2 細(xì)胞OGD 3 h 后細(xì)胞的生存率較未進(jìn)行OGD 的對照組明顯降低（P＜0.01），給予烏帕替尼后生存率較OGD 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖1A）；在OGD 4 h 后，與對照組相比，OGD 組細(xì)胞生存率明顯降低（P＜0.01），而與OGD 組相比，烏帕替尼200 μmol/L 濃度下能顯著提高BV2 細(xì)胞生存率（P＜0.05）（圖1B）。因此，選擇OGD 4 h 作為后續(xù)實驗條件，選擇烏帕替尼200 μmol/L 作為后續(xù)實驗藥物濃度。

3.2 烏帕替尼對OGD/R 后BV2 細(xì)胞極化的影響

結(jié)果如圖（圖2）所示，與對照組相比，OGD 組BV2 細(xì)胞M1 型標(biāo)志物：CD11b、CD32、iNOS 的mRNA 水平均明顯增加（P＜0.05），而M2 型標(biāo)志物：Arg-1、IL-10、CD206 的mRNA 水平改變無統(tǒng)計學(xué)意義。與OGD 組相比，給予烏帕替尼后CD11b（P＜0.01）、CD32（P＜0.05）、iNOS（P＜0.01）的mRNA水平均顯著減少，M2 型標(biāo)志物mRNA 水平改變無統(tǒng)計學(xué)意義。

3.3 烏帕替尼對BV2 細(xì)胞OGD 后遷移能力的影響

從細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果（圖3）中可以看出，與對照組相比，OGD 組BV2 細(xì)胞在6 h（P＜0.05）、12 h（P＜0.05）和24 h（P＜0.01）細(xì)胞遷移率均明顯增加，而與OGD 組相比，烏帕替尼給藥組在6 h 和12 h細(xì)胞遷移率的改變無統(tǒng)計學(xué)意義，在給藥24 h 后的細(xì)胞遷移率明顯降低（P＜0.05）。

3.4 烏帕替尼對BV2 細(xì)胞OGD/R 后培養(yǎng)基中炎性因子水平的影響

與對照組相比，OGD 組培養(yǎng)基中IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平均明顯升高（P＜0.01）。與OGD 組相比，烏帕替尼給藥組IL-1β（P＜0.05）、IL-6（P＜0.01）、TNF-α（P＜0.05）等3 種炎性因子水平均顯著降低（圖4）。

3.5 烏帕替尼對共培養(yǎng)PC12 細(xì)胞OGD 后細(xì)胞生存率的影響

結(jié)果如圖所示，與對照組相比，條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)12 h 的OGD 組PC12 細(xì)胞生存率明顯降低（P＜0.01），在給予烏帕替尼條件培養(yǎng)基后，PC12 細(xì)胞生存率較OGD 組增加無統(tǒng)計學(xué)意義（圖5A）；共培養(yǎng)24 h 的OGD 組細(xì)胞生存率較對照組明顯減少（P＜0.01），而烏帕替尼組較OGD 組PC12 細(xì)胞生存率明顯增加（P＜0.05）（圖5B）。

圖1 烏帕替尼對OGD/R 誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞損傷的影響

3.6 烏帕替尼對OGD/R 后BV2 細(xì)胞JAK1/STAT6信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

結(jié)果如圖所示，在OGD/R 損傷后，BV2 細(xì)胞p-JAK1 和p-STAT6 蛋白表達(dá)水平較對照組顯著增加（P＜0.01），在給予烏帕替尼后，p-JAK1 和p-STAT6 蛋白表達(dá)水平較OGD 組顯著降低（P＜0.01）（圖6B, 6C）。

圖2 烏帕替尼對OGD/R 后BV2 細(xì)胞極化的影響

圖3 烏帕替尼對BV2 細(xì)胞OGD 后遷移能力的影響

4 討論

神經(jīng)炎癥與神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)[14]，而小膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)參與炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)刺激后活化，根據(jù)其激活狀態(tài)分為M1 型和M2 型2 種表型，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的小膠質(zhì)細(xì)胞可以是促炎的，也可以有神經(jīng)保護(hù)的作用，這取決于它們的激活狀態(tài)。促炎型小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)促炎因子IL-1、TNF-α、IL-6、一氧化氮(NO)等，會對神經(jīng)系統(tǒng)有不利影響[15]；而抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞則會引起多種抗炎因子釋放，如FIZZ1、Chi3I3、精氨酸酶1、Ym1、CD206、胰島素樣生長因子1（IGF-1）和Fzd1 等，這些細(xì)胞因子可能參與神經(jīng)保護(hù)和組織愈合[16]。

圖4 烏帕替尼對BV2 細(xì)胞OGD/R 后培養(yǎng)基中炎性因子水平的影響

圖5 烏帕替尼對共培養(yǎng)PC12 細(xì)胞OGD 后細(xì)胞生存率的影響

圖6 烏帕替尼對OGD/R 后BV2 細(xì)胞JAK1/STAT6 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

哺乳動物JAK 激酶家族由3 個JAKs（JAK1、JAK2、JAK3）和酪氨酸激酶2（TYK2）組成，它們經(jīng)多種細(xì)胞因子觸發(fā)，選擇性地結(jié)合不同的受體，從而作為信號傳導(dǎo)器在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用[17]。JAK 激酶激活下游的STAT 蛋白，激活的STAT 蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核，上調(diào)促炎性細(xì)胞因子和生長因子基因[18]。本研究將JAK1 選擇性抑制劑烏帕替尼作用于OGD/R 后的BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果顯示烏帕替尼能增加OGD/R 后BV2 細(xì)胞的生存率。在發(fā)生急性腦卒中后，腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞通常會遷移至損傷部位[19]，而受到損傷部位刺激后，小膠質(zhì)細(xì)胞會極化為M1 型加重了缺血損傷[20]，于是筆者對BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞OGD/R 后的極化和遷移能力進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)BV2 細(xì)胞在OGD/R 后，其M1 型標(biāo)志物CD11b、CD32、和iNOS 的mRNA 水平明顯升高，在烏帕替尼處理后，M1 型標(biāo)志物水平明顯減少，這個結(jié)果表明，烏帕替尼能抑制BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞向M1 型極化，劃痕實驗結(jié)果可以看出烏帕替尼能抑制BV2 細(xì)胞OGD/R 后的遷移能力。為了進(jìn)一步研究小膠質(zhì)細(xì)胞極化后對神經(jīng)系統(tǒng)的影響，本實驗檢測了OGD/R 后BV2 細(xì)胞培養(yǎng)基中炎癥因子的含量，研究結(jié)果顯示，烏帕替尼可減少OGD/R 后BV2 細(xì)胞分泌的炎癥因子。之后將OGD/R 后的BV2 細(xì)胞條件培養(yǎng)基稀釋一半后加入到OGD 4 h 后的PC12 細(xì)胞中，實現(xiàn)OGD/R后BV2 細(xì)胞的條件培養(yǎng)基與OGD 后PC12 細(xì)胞之間的共培養(yǎng)，共培養(yǎng)結(jié)果顯示，經(jīng)烏帕替尼處理的BV2 細(xì)胞的條件培養(yǎng)基能提高OGD/R 后PC12 細(xì)胞的生存率。烏帕替尼為JAK1 選擇性抑制劑，而JAK/STAT 信號通路與神經(jīng)炎癥密切相關(guān)，于是本研究通過Western blot 檢測烏帕替尼對OGD 4 h/R 24 h 后BV2 細(xì)胞JAK1/STAT6 信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)經(jīng)OGD/R 處理后的BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞JAK1 和STAT6 磷酸化蛋白的表達(dá)水平明顯增加，而烏帕替尼處理后可明顯減少JAK1 和STAT6 蛋白的激活，從而抑制BV2 細(xì)胞炎癥通路，減少由BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)激活后引起的神經(jīng)炎癥。

綜上所述，烏帕替尼能抑制BV2 細(xì)胞經(jīng)OGD/R刺激后向M1 型極化，抑制其遷移能力并減少炎癥因子的釋放，通過調(diào)控JAK1/STAT6 信號通路抑制炎癥反應(yīng)起到神經(jīng)保護(hù)的作用。烏帕替尼目前已被批準(zhǔn)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療，但是對神經(jīng)系統(tǒng)炎癥疾病治療的研究非常少，其抑制JAK/STAT 信號通路對腦缺血損傷可能具有保護(hù)作用。